Biofilme in Melkanlagen

Abstract

Die bakterielle Zusammensetzung von Biofilmen in Melkanlagen wurde mit einer Kombination aus kultivierungsgestützten und molekularbiologischen Methoden ermittelt. Bereits in der Melkanlage etablierte Biofilme wurden mit Tupfern beprobt. Zusätzlich wurde die Biofilmbildung auf in die Melkanlage eingebrachten Edelstahlcoupons nachvollzogen, die nach mehreren Melkintervallen entnommen und untersucht wurden. Aus den Tupferproben und von den Edelstahlcoupons wurde sowohl die DNA extrahiert als auch Isolate gewonnen. Für die kultivierungsunabhängige Diversitätsanalyse wurden die 16S rRNA-Gene mittels PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. Die Identifizierung der Isolate erfolgte mit einer Kombination aus chemotaxonomischen Methoden und 16S rRNA-Gensequenzierung. Zur Beurteilung ihres Verderbnispotentials wurden die Isolate auf ihre Fähigkeit zur Biofilmbildung, Wachstum bei Kühltemperaturen und Zersetzung von Milchbestandteilen durch Proteolyse und Lipolyse getestet. <br /> Das Vorhandensein von Biofilmen auf verschiedenen Materialien wie Edelstahl, Gummi und Kunststoff wurde über mehrere Probenahmen hinweg nachgewiesen. Besonders hohe Keimzahlen wurden auf den Melkbecherablagen, einem Kunststoffrohr am Ende der Druckleitung sowie auf dem Auslassstutzen des Rohmilchsammeltanks detektiert. Anhand von hohen Anteilen cloxacillinresistenter Mikroorganismen konnte ein Zusammenhang zwischen dem präventiven Einsatz dieses Wirkstoffs beim Trockenstellen der Milchkühe und erhöhtem Auftreten von Antibiotikaresistenzen nachgewiesen werden. <br /> Alle Isolat- und Klonsequenzen gehörten den typischen milchassoziierten Phyla <em>Actinobacteria</em>, <em>Bacteroidetes</em>, <em>Firmicutes</em> und <em>Proteobacteria</em> an. Die Ergebnisse aus der vorliegenden Arbeit lassen darauf schließen, dass verschiedene Gattungen des Phylums <em>Actinobacteria</em> eine wichtige Rolle als Primärbesiedler von Edelstahloberflächen spielen, während ihr Anteil in reifen Biofilmen abnimmt. Der Nachweis von <em>Listeria monocytogenes</em> als Klonsequenz auf mehreren Edelstahlcoupons weist auf die Fähigkeit dieses Pathogens hin, sich schon in frühen Phasen der Biofilmbildung in den Biofilm in geringen Anteilen zu integrieren. Milchsäurebakterien sowie die Gattungen <em>Kocuria</em>, <em>Micrococcus</em>, <em>Bacillus</em>, <em>Staphylococcus</em>, <em>Chryseobacterium</em> und <em>Acinetobacter</em> scheinen aufgrund ihrer hohen Speziesvielfalten, ihres Produktverderbnispotentials, psychrophilen Eigenschaften, ihres Biofilmbildungspotentials und Resistenz gegenüber den in der Melkanlage eingesetzten Reinigungs- und Desinfektionsmitteln eine bedeutende Rolle in Melkanlagen-Biofilmen zu spielen. Viele der genannten Gattungen wiesen zusätzlich Antibiotikaresistenzen auf, was eine Gefahr für die Eutergesundheit im Falle einer Mastitisinfektion darstellt.<br /> Verstärkte Biofilmbildung in Lactose-haltigem Nährmedium zeigte deutlich die Adaption vieler Isolate an Milch als ihr natürliches Habitat. Differentielle Genexpressionsanalysen von zwei Isolaten der Spezies <em>Acinetobacter guillouiae</em> und <em>Kocuria salsicia</em> deuteten auf eine Induktion von EPS-assoziierten Genen durch Lactose hin.

<strong>Biofilms in milking machines</strong><br /> The bacterial community composition of biofilms in a milking machine was assessed by a combination of cultivation and molecular methods. Already established biofilms were investigated by swab sampling of different parts of the milking machine. Biofilm formation was also traced on stainless steel coupons that were placed into the piping system of the milking machine and were removed after several milking intervals. Swab samples and exposed stainless steel coupons were used for the isolation of DNA followed by analysis of target genes and also for the isolation of bacterial strains. Isolates were differentiated and identified by a combination of chemotaxonomical methods and 16S rRNA sequencing. The culture-independent diversity analyses involved PCR-amplification, cloning and sequencing of the 16S rRNA genes. Isolates were characterized for their milk spoilage potential by lipolysis and proteolysis as well as growth and biofilm formation at refrigeration temperature.<br /> The presence of biofilms was demonstrated on several surface materials including stainless steel, rubber and plastic. High microbial loads were detected on the milking equipment retainers, a plastic pipe at the end of the pressure line and the outlet of the raw milk bulk tank. The relation between the preventive use of cloxacillin at drying off and the extent of resistant bacterial populations within the existing biofilms was clearly shown. However, no correlation was found between biofilm microbial cell density and abundance of tetracycline resistance genes. That means there is no evidence for a substantial contribution of horizontal gene transfer for the dissemination of antibiotic resistance genes in this habitat.<br /> All isolate and clone sequences belonged to the typical milk associated phyla <em>Actinobacteria</em>, <em>Bacteroidetes</em>, <em>Firmicutes</em> and <em>Proteobacteria</em>. The results indicate that different genera of the phylum <em>Actinobacteria</em> play a role as primary colonizers of stainless steel surfaces while their proportion decreased in mature biofilms. The detection of <em>Listeria monocytogenes</em> as clone sequence from different stainless steel coupons indicates that this pathogen can integrate already in early stages of biofilm formation in small proportions, as it was not detected by cultivation. Lactic acid bacteria as well as the genera <em>Kocuria</em>, <em>Micrococcus</em>, <em>Bacillus</em>, <em>Staphylococcus</em>, <em>Chryseobacterium</em> and <em>Acinetobacter</em> played a prominent role in milking machine biofilms due to their high species richness, milk spoilage potential, psychrotrophic adaptation, biofilm formation and/or resistance against the cleaning and disinfection agents used in the milking machine. Most of these genera were also resistant against β-lactam antibiotics or tetracycline, which threatens udder health in case of mastitis infection. The cleaning and disinfection agents were able to kill the majority of biofilm cells in most cases but failed to eradicate the biofilm matrix. <br /> Enhanced biofilm formation by many isolates in lactose-containing medium clearly indicated their adaptation to milk as their natural habitat. Differential gene expression analysis of two isolates of the species <em>Acinetobacter guillouiae</em> and <em>Kocuria salsicia</em> indicated the induction of EPS-associated genes by the presence of lactose.