Toxicogenomic studies of the effects of insecticides on the western honey bee (<em>Apis mellifera</em>; Hymenoptera: Apidae)

Abstract

Pollinator health and safety are among the most intense and controversially discussed topics in science, public and politics of the last years. The use of insecticides and their potential effects on the western honey bee <em>Apis mellifera</em> L. (Hymenoptera: Apidae), as well as other bee species, have become a core part of this debate.<br /> In particular, insecticides belonging to the chemical class of neonicotinoids have been occasionally accused to be a key driver in pollinator decline worldwide. Neonicotinoids are systemic insecticides that act as partial agonists of the postsynaptic nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) of insects and are widely applied to combat sucking and certain chewing pest species. Different neonicotinoids display differences in their intrinsic toxicity on honey bees with the <em>N</em>-cyanoamidines thiacloprid and acetamiprid acting about two to three orders of magnitude less toxic compared to <em>N</em>-nitroguanidines such as imidacloprid.<br /> In this thesis, light was shed on the biochemical and molecular mechanisms underlying the honey bee sensitivity towards certain neonicotinoid insecticides.<br /> Radioligand binding assays conducted on head membrane preparations of the honey bee revealed that thiacloprid and imidacloprid display a similar nanomolar binding affinity to postsynaptic nAChRs. In conclusion, the toxicity difference of the compounds does not derive at the molecular target and has to have another origin. <br /> A number of published studies indicated that cytochrome P450 monooxygenases (450s) play a crucial role in the oxidative metabolism of neonicotinoid insecticides in the honey bee. Thus, different <em>in vivo</em> and <em>in vitro</em> methods were developed to mechanistically assess the interaction of selected neonicotinoid insecticides with honey bee P450s.<br /> First, the previously described problems associated with the isolation of functional microsomes from abdominal preparations of honey bees were approached and solved by the simple removal of the venom gland sting complex prior to tissue homogenization. A detailed method for the isolation of highly active microsomes from whole worker abdomen is outlined and compelling evidence depicted that the bee venom compound phospholipase A₂ is responsible for the inactivation of microsomal P450s, most likely by disintegration of the microsomal membranes. In addition to the characterization of the detoxification capacity of microsomal P450 with fluorescence based model substrates, the significantly faster P450-driven detoxification of thiacloprid in comparison to imidacloprid was demonstrated <em>in vitro</em>. <br /> Important insights on the role of individual P450s belonging to the monophyletic group 3 in the oxidative metabolism of the selected neonicotinoid insecticides were obtained from studies with functional expressed enzymes. The three honey bee P450s belonging to CYP9Q-subfamily have been identified as key enzymes in the rapid metabolism of <em>N</em>-cyanoamidine neonicotinoid insecticides with CYP9Q3 highlighted as the particular key enzyme involved in the rapid detoxification of thiacloprid by hydroxylation <em>in vitro</em>. The turnover of imidacloprid by this enzyme family was significantly lower; thus enzymes belonging to CYP9Q-subfamily were identified as molecular determinants mediating bee sensitivity to neonicotinoid insecticides.<br /> A new method was developed in order to elucidate the in vivo metabolism and pharmacokinetics of the selected [¹⁴C]-labelled neonicotinoids after contact exposure. This study demonstrated that the <em>N</em>-cyanoamidines thiacloprid und acetamiprid displaying a lower acute intrinsic toxicity to honey bees showed a slower penetration through the honey bee cuticle in line with a faster metabolization and elimination rate compared to the intrinsically highly toxic <em>N</em>-nitroguanidine imidacloprid. Applying this method, the <em>in vivo</em> metabolic fate of thiacloprid in honey bees was elucidated for the first time. The study completed a knowledge gap on the contact mode of entry of neonicotinoids and identified the pharmacokinetics as another factor contributing to the lower intrinsic toxicity of thiacloprid and acetamiprid after contact exposure to honey bees.<br /> The outlined toxicogenomic studies provide a mechanistic view on the interaction of honey bees with selected neonicotinoid insecticides. The established biochemical and molecular methods are ready to be applied to address fundamental research questions, as well as applied questions in the bee safety evaluation of crop protection products.

Die Gesundheit von Bestäuberinsekten und ihr Schutz sind intensiv und kontrovers diskutierte Themen in Wissenschaft, Öffentlichkeit und Politik der letzten Jahre. Ein Kernstück dieser Debatte ist der Einsatz von Insektiziden und ihre potentiellen Effekte auf die westliche Honigbiene <em>Apis mellifera</em> L. (Hymenoptera: Apidae) sowie andere Bienenarten. <br /> Insbesondere Insektizide, die zur Klasse der Neonikotinoide gehören, wurden gelegentlich beschuldigt, eine Hauptursache des Rückgangs von Bestäuberinsekten weltweit zu sein. Neonikotinoide sind systemische Insektizide und binden als partielle Agonisten an die postsynaptischen nikotinergen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) von Insekten. Sie werden breitflächig zur Bekämpfung von saugenden und bestimmten beißenden Schadinsekten angewendet. Verschiedene Neonikotinoide zeigen abhängig von ihrer Pharmakophorstruktur signifikante Unterschiede in ihrer intrinsischen Toxizität gegenüber <em>A. mellifera</em>. Die <em>N</em>-cyanosubstituierten Moleküle Thiacloprid und Acetamiprid weisen eine zwei bis drei Zehnerpotenzen geringere intrinsische Toxizität auf als N-nitro-substituierte Moleküle, beispielsweise Imidacloprid. <br /> Die biochemischen und molekularen Mechanismen, die der Sensitivität von Bienen gegenüber den genannten Neonikotinoiden zugrunde liegen, wurden in dieser Arbeit untersucht. Radioligandenbindungsstudien, die an Kopfmembranpräparationen der Honigbiene durchgeführt wurden, zeigten, dass Thiacloprid und Imidacloprid mit einer ähnlichen nanomolaren Affinität an ihren molekularen Wirkort binden. Folglich muss der Sensitivitätsunterschied einen anderen Ursprung haben. <br /> Eine Vielzahl von publizierten Studien indizierten, dass Cytochrom P450 Monooxygenasen (P450s) wichtige Enzyme im oxidativen Abbau von Neonikotinoiden in der Honigbiene sind. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene <em>in vivo </em>und <em>in vitro</em> Methoden entwickelt, um die Interaktion der ausgewählten Neonikotinoide mit den P450s von <em>A. mellifera</em> mechanistisch zu studieren. Die in der Vergangenheit beschriebenen Probleme, die mit der Isolation funktioneller Mikrosomen aus abdominalen Präparationen von Honigbienen assoziiert sind, wurden aufgegriffen und durch das simple Entfernen des Giftblase-Stachel-Komplexes vor der Gewebeaufarbeitung gelöst. Eine detaillierte Methode zur Isolation hochfunktioneller Mikrosomen aus Abdomen von Arbeiterinnen wurde beschrieben und der Bienengiftbestandteil Phospholipase A₂ als Faktor, der zur Inaktivierung mikrosomaler P450s vermutlich durch Desintegration der Mikrosomenmembranen führt, identifiziert. Neben der Charakterisierung der metabolischen Kapazität von mikrosomalen P450s mit Hilfe von fluoreszenzbasierten Modellsubstraten, konnte zudem eine signifikant schnellere Detoxifizierung von Thiacloprid im Vergleich zu Imidacloprid in <em>vitro </em>gezeigt werden.<br /> Des Weiteren lieferten <em>in vitro</em> Studien an funktionell exprimierten P450s der monophyletischen Gruppe 3 wichtige Erkenntnisse über die Rolle einzelner Enzyme im oxidativen Metabolismus der ausgewählten Neonikotinoide. Dabei wurden die drei Enzyme, die der CYP9Q-Subfamilie von <em>A. mellifera</em> angehören, im schnellen Abbau von Thiacloprid und Acetamiprid identifiziert. Das Enzym CYP9Q3 stach als effizienter Hauptmetabolisierer von Thiacloprid mittels Hydroxylierung heraus. Gegenüber Imidacloprid zeigten die CYP9Q-Enzyme einen signifikant geringeren Abbau <em>in vitro</em> und konnten somit als Schlüsselenzyme, die der Bienensensitivität gegenüber Neonikotinoiden zugrunde liegen, beschrieben werden. <br /> Zudem wurde eine Methode entwickelt, um den <em>in vivo</em> Metabolismus und die Pharmakokinetik von [¹⁴C]-markierten Neonikotinoiden nach Kontaktapplikation aufzuklären. Dabei zeigte sich, dass die intrinsisch weniger toxischen <em>N</em>-Cyanoamidine Thiacloprid und Acetamiprid langsamer durch die Kutikula der Honigbiene penetrieren sowie schneller metabolisiert und ausgeschieden werden, als das intrinsisch hochtoxische <em>N</em>-Nitroguanidin Imidacloprid. Unter Anwendung der Methode konnte erstmals der <em>in vivo</em> Metabolismus von Thiacloprid in der Honigbiene aufgeklärt werden. Darüber hinaus konnte eine Wissenslücke über das Verhalten von Neonikotinoiden nach Kontaktapplikation geschlossen werden und die Pharmakokinetik als ein weiterer Faktor, welcher der geringeren intrinsischen Toxizität von <em>N</em>-cyano-substituierten Neonikotinoiden zugrunde liegt, beschrieben werden. <br /> Die vorliegenden toxikogenomischen Studien betrachten mechanistisch die molekularen und biochemischen Interaktionen von Insektiziden mit der westlichen Honigbiene. Darüber hinaus können die entwickelten Methoden in der Beantwortung von wissenschaftlichen sowie angewandten Fragestellungen für die Evaluation der Bienensicherheit von Pflanzenschutzmitteln Anwendung finden.