Transcription factors mediated oxidative stress response in bovine follicular cells and preimplantation embryos

Abstract

Transcription factors (TFs) are DNA-binding proteins implicated in regulation of gene activity and subsequently several biological functions under physiological, pathological and stress conditions. Oxidative stress can be generated naturally or upon exposure to environmental factors that ultimately affect cattle fertility. However, the role and regulation of TFs mediated-oxidative stress response in bovine follicular cells and preimplantation embryos remain elusive. Therefore, this dissertation aims to elucidate the expression pattern, crosstalk, and extracellularly released-TFs under stress condition. To address that, three independent experiments were conducted. In the first experiment, the sub-confluent bovine granulosa cells were treated with H2O2 to induce oxidative stress. In the second experiment, NRF2 was selectively knocked down using siRNA. Cells of both experiments were subjected to cellular phenotypes in addition to expression pattern analysis of TFs, endoplasmic reticulum, differentiation and apoptosis genes. In the third experiment, the male and female zygotes were cultured until blastocyst stage under 5% or 20% oxygen levels. Blastocysts were subjected to reactive oxygen species (ROS) level, total cell count assays and mRNA quantification for candidate TFs, antioxidants as well as extracellular vesicles’ (EVs) biogenesis and secretion genes. Thereafter, EVs were isolated from spent culture media of embryos and subjected to mRNA quantification of candidate TFs. Results revealed that oxidative stress increased intercellular ROS levels and reduced mitochondrial activity accompanied by lipids accumulation and DNA fragmentation in granulosa cells. Consequently, oxidative stress-induced NRF2 was coupled with differentially expressed candidate TFs associated with a reduction of cell proliferation. Intriguingly, inhibition of NRF2 resulted in upregulation of KLF4 and its target genes, which in turn reduced cellular proliferation. Likewise, high oxygen tension reduced blastocyst rate, total cell number and increased ROS levels in both male and female embryos. Contrary to female embryos, the mRNA expression level of NRF2, KLF4 and SREBF2 was upregulated in male embryos under high oxygen level. Concomitantly, released EVs packed with higher mRNA levels of NRF2 and NOTCH. In conclusion, bovine granulosa cells and preimplantation embryos respond to environmental stressors by differential regulation of TFs.

<strong>Transkriptionsfaktoren vermittelte oxidative Stressantwort in Rinderfollikelzellen und Präimplantationsembryonen</strong><br /> Transkriptionsfaktoren (TFs) sind DNA-bindende Proteine, die an der Regulation der Genaktivität und anschließend an verschiedenen biologischen Funktionen unter physiologischen-, pathologischen- und Stressbedingungen beteiligt sind. Oxidativer Stress kann auf natürliche Weise oder durch Einwirkung von Umweltfaktoren erzeugt werden, die letztendlich die Fruchtbarkeit von Rindern beeinflussen. Die Rolle und Regulation der durch TFs vermittelten oxidativen Stressantwort in Rinderfollikelzellen und Präimplantationsembryonen ist jedoch nach wie vor unklar. Ziel dieser Dissertation ist es daher, das Expressionsmuster, das Zusammenwirken und die extrazellulär freigesetzten TFs unter Stressbedingungen aufzuklären. Um dies zu untersuchen, wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Im ersten Experiment wurden die subkonfluenten Rindergranulosazellen mit H2O2 behandelt, um oxidativen Stress zu induzieren. Im zweiten Versuch wurde NRF2 mittels siRNA selektiv ausgeschaltet. Zusätzlich zur Expressionsanalyse von TFs-, endoplasmatischem Retikulum-, Differenzierungs- und Apoptosegenen wurden die zellulären Phänotypen der Zellen beider Experimente bestimmt. Im dritten Experiment wurden die männlichen und weiblichen Zygoten bis zum Blastozystenstadium unter 5% oder 20% Sauerstoffgehalten kultiviert. Die Blastozysten wurden auf ihren Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Gesamtzellzahl untersucht und mittels mRNA-Quantifizierung von TFs-, Antioxidantien sowie Biogenese- und Sekretionsgene extrazellulärer Vesikel (EVs) auf ihre Expression analysiert. Danach wurden EVs aus benutzen Kulturmedien von Embryonen isoliert und einer mRNA-Quantifizierung mit TF Kandidatengenen unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass oxidativer Stress den interzellulären ROS-Spiegel erhöhte und die mitochondriale Aktivität verringerte, begleitet von Lipidakkumulation und DNA-Fragmentierung in Granulosazellen. Folglich wurde durch oxidativen Stress induziertes NRF2 mit differentiell exprimierten TF Kandidatengenen gekoppelt, die mit einer Verringerung der Zellproliferation verbunden waren. Interessanterweise führte die Hemmung von NRF2 zu einer Hochregulation von KLF4 und seinen Zielgenen, was wiederum die Zellproliferation verringerte. Ebenso verringerte eine hohe Sauerstoffkonzentration die Blastozystenrate und die Gesamtzellzahl und erhöhte die ROS-Werte sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Embryonen. Im Gegensatz zu weiblichen Embryonen war das mRNA-Expressionsniveau von NRF2, KLF4 und SREBF2 in männlichen Embryonen unter hohem Sauerstoffgehalt hochreguliert. Gleichzeitig enthielten die freigesetzten EVs einen höheren mRNA-Spiegel von NRF2 und NOTCH. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Rindergranulosazellen und Präimplantationsembryonen auf Umweltstressoren durch unterschiedliche Regulation von TFs reagieren.