Talentierte symbiontische Naturstoffproduzenten als Quelle neuer Wirkstoffe

Abstract

Zunehmende Resistenzen und gleichzeitig sinkende Zahlen neu zugelassener Antibiotika lassen den Bedarf an neuen antibiotischen Wirkstoffen steigen. Aber auch in anderen medizinischen Bereichen wie z. B. der Onkologie ist der Bedarf an neuen pharmakologisch wirksamen Leitstrukturen hoch. Ein Ansatz, an neue bioaktive Molekülstrukturen zu gelangen, ist die Naturstoffforschung. Zwei Klassen von Naturstoffen, Polyketide und nichtribosomalen Peptide sind dabei von besonderem Interesse, da viele dieser Stoffe pharmakologische Wirkungen aufweisen. Diese werden meist als Sekundärmetabolite von symbiontisch lebenden Bakterien gebildet und nicht wie meist zunächst angenommen von den Wirtsorganismen wie z. B. Schwämmen oder anderen Invertebraten. So bieten diese meist noch unbekannten Bakterienspezies ein enormes, oft noch ungenutztes Potenzial in der Wirkstoffforschung. In dieser Arbeit wurden einige dieser potenten Naturstoffproduzenten untersucht. Aus dem Schwamm Theonella swinhoei, aus dem bereits viele Naturstoffe bekannt waren, wurde in Vorarbeiten ein filamentöses Bakterium untersucht. Erste Experimente gaben Hinweise darauf, dass viele dieser Naturstoffe nicht vom Schwamm selbst sondern tatsächlich von diesem Bakterium produziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Jörn Kalinowski (Universität Bielefeld, Verbundprojekt GenBioCom) und Dr. Agus Uria, Dr. Micheal Wilson und Nina Heycke das Genom dieses Symbionten sequenziert und verbleibende Sequenzlücken mithilfe kombinatorischer PCR geschlossen. So konnten viele der Naturstoffgencluster assembliert und 'Candidatus Entotheonella factor' (lat. factor, der Produzent) als Produzent nahezu aller Polyketide und nichtribosomalen Peptide aus dem Schwamm Theonella swinhoei bestätigt werden. Erste phylogenetische Analysen dieses Naturstoffproduzenten gaben Anhaltspunkte dafür, dass weitere Mitglieder der Gattung 'Entotheonella' auch in anderen Habitaten zu finden sind (z. B. NCBI GenBank: JN178754, AY493913, JN825509). Um die Verbreitung und das metabolische Potential dieser Spezies zu analysieren, wurden in dieser Arbeit verschiedene Umweltproben untersucht. Dabei zeigte sich, dass mehr als die Hälfte (62,9%) der untersuchten Bodenproben nah verwandte Spezies zu 'E. factor' (Mitglieder desselben Genus, derselben Familie bzw. Ordnung) enthalten. Zur weiteren Untersuchung dieser bisher noch unbekannten Spezies der Bodenproben wurde versucht, diese aus den Umweltproben zu isolieren. Mithilfe einer spezifischen Sonde für 'E. factor' konnten in einem CARD-FISH-Experiment Bakterien in einigen Bodenproben markiert und visualisiert werden. Dieses Ergebnis konnte jedoch nicht reproduziert werden. Amplikon-Sequenzierungen zeigten, dass der Anteil an 'Candidatus Entotheonella' - bzw. 'Candidatus Tectomicrobia'-Spezies am Mikrobiom der Proben gering ist (0,0008-0,002%). Versuche, diese Spezies zu separieren und aufzukonzentrieren, waren nur teilweise erfolgreich (max. Anteil dieser Bakterien am Mikrobiom auf 0,15%). Daher kann bisher keine Aussage über das Potential dieser Bakterien als Naturstoffproduzenten getroffen werden. Phylogenetische Analysen bestätigten, dass sowohl 'E. factor', als auch die verwandten Spezies aus den Bodenproben, nicht wie bisher vermutet dem Phylum der Proteobakterien angehören, sondern ein eigenes, bisher unbeschriebenes Kandidatenphylum bilden ('Tectomicrobia', lat.: tegere, sich verbergen, etwas schützen). Mithilfe einer phylogenetischen Analyse der aus den Bodenproben gewonnenen 78 16S rRNA-Gensequenzen und weiteren 562 Sequenzen einer Datenbankrecherche konnte das neue Kandidatenphylum 'Tectomicrobia' erstmals charakterisiert werden. <br /> In Vorarbeiten wurde, ebenfalls aus dem Schwamm Theonella swinhoei, ein weiteres filamentöses Bakterium (Symbiont 2) isoliert. Erste Genom-Sequenzierungen und anschließende Analysen zeigten, dass auch im Genom dieses Bakteriums eine enorme Anzahl an Naturstoffgenclustern enthält. In dieser Arbeit konnten insgesamt 49 Contigs mit Fragmenten von Naturstoffclustern identifiziert werden, davon 36 PKS und NRPS Gencluster. Insgesamt konnten 39 A-Domänen, 11 KS-Domänen, 35 C-Domänen annotiert werden. Einige dieser Contigs wurden mittels kombinatorischer PCR verbunden. <br /> Das Genom des als Pederin-Produzent bekannte Paederus-Symbiont 'Candidatus Pseudomonas paederi' wurde in Vorarbeiten sequenziert. In dieser Arbeit konnten einige der verbliebenen Sequenzlücken durch kombinatorische PCR geschlossen werden. Das Genom beherbergt neben dem Biosynthesecluster für Pederin einen weiteren PKS/NRPS-Gencluster. Zur Vorhersage des Naturstoffes ist es notwendig, die Spezifität der A-Domäne und damit der in der Synthese eingebauten Bausteine zu kennen. Dazu sollte die bioinformatische Vorhersage der Spezifität in vitro experimentell überprüft werden. In dieser Arbeit konnte eine der beiden enthaltenen A-Domänen heterolog exprimiert werden. Aufgrund fehlender Aktivität konnte jedoch keine Aussage zur Spezifität getroffen werden.