Analyse des Lon Einflusses auf die Hitze-induzierte Aggregation mitochondrialer Proteine und auf die Bildung von Aggregatablagerungen

Abstract

Die mitochondriale Matrix Protease Lon ist ein essentieller Bestandteil des mitochondrialen Protein Qualitätskontroll-Systems. Der Verlust von Lon führt zu einer erhöhten Apoptoserate und embryonaler Letalität im Mausmodell. Des Weiteren korrelieren Alterungsprozesse mit einer Reduktion von Lon. Bisher wurden der Verlust von Lon in transient transfizierten Zellen mit siRNA-vermitteltem Lon Knockdown untersucht. Die Reduktion der Lon-Proteinmenge war nur temporär und sehr variable und an diesen Zellen konnten langfristige Anpassungsprozesse wie das Altern nicht untersucht werden. Für die Analyse der Auswirkungen eines Lon Verlustes auf humane HeLa Zellen, wurde eine genetischer Lon Knockdown (gKD) konstruiert und charakterisiert. Die Reduktion von Lon auf 27% führt zu einer verringerten Stressresistenz. Die Lon Aktivität scheint in diesen Zellen erhöht zu sein um negative Effekte des Lon Verlustes zu reduzieren. Die Proteomanalyse zeigte eine auffällige Zunahme der Importrezeptoren, allerdings wurde beim mitochondrialen Import keine Unterschiede zwischen Lon gKD und WT Zellen beobachtet, was auf eine Kompensation des Imports hinweist. Des Weiteren wurde der Einfluss von Lon auf das Hitze-induzierte Aggregationsverhalten mitochondrialer Proteine analysiert. Dieser zeigte, dass besonders Proteine, die an der mitochondrialen Translation beteiligt sind, in Lon gKD Mitochondrien aggregieren. Die dadurch entstandene Hemmung der mitochondrialen Translation könnte als Schutz vor der Akkumulation von fehlgefalteten mitochondrial codierten Proteinen dienen. Als weiterer Schutzmechanismus vor proteotoxischen Effekten dient die Ablagerung fehlgefalteter Proteine in Aggregate. HeLa Zellen lagern Aggregate ebenfalls innerhalb der mitochondrialen Netzwerke an ein bis zwei Punkten ab, dabei führt der Verlust von Lon zu einer verlangsamten Ablagerung. Daher ist Lon ein essentieller Faktor Der Verlust von Lon führt zu einer verlangsamten Bildung von Proteinaggregaten. Lon ist ein essentieller Faktor in der Antwort auf proteotoxischen Stress. Die vorgestellte Lon gKD Zelllinie bietet ein gutes Modell für die Analyse der Lon Funktion in Alterungsprozessen sowie die Verarbeitung und Prävention von Aggregaten in Mitochondrien.

The mitochondrial matrix protease Lon is the essential part of the organelle quality control system. Loss of Lon leads to an increase in apoptosis and to embryonic lethality in mice. Furthermore, reduction in Lon-Protein level correlates with ageing processes. Up to now, loss of Lon was studied in transient transfected cells with siRNA mediated Lon knockdown. These siRNA knockdowns were very variable, since most of the studies used a transient transfection and Lon-Protein level is viable as well. These cells were not useful to study long-term adaption processes, like ageing. To analyse the cellular adaptation in human HeLa cells, a CRISPR/Cas mediated genetical Lon knockdown (gKD) was constructed and characterized. The stable reduction of Lon to 27% leads to a decreased stress resistance. Cells showed no changes of mitochondrial network morphology. Lon activity was increased in Lon gKD cells, probably to compensate negative effects of Lon loss. Proteomic analysis showed an increase of the amount of import receptors, while mitochondrial import is not affected. The heat-induced aggregation behavior was also affected by the loss of Lon, especially members of mitochondrial translation were affected. The decrease of mitochondrial translation could serve to reduce the accumulation of misfolded proteins and thus decrease proteomics stress. In yeast a sequestration of aggregates to reduce proteotoxic effects was previously observed, similar sequestration was observed in HeLa cells as well. The loss of Lon leads to a slower deposition of these aggregates. This indicated that Lon is an essential factor in proteotoxic stress response and necessary for a fast deposition of misfolded proteins into aggregate sequestration sites. To summarize all results, Lon proteolytic function is essential for cell survival. The presented Lon gKD cell line is a useful model for studying ageing processes as well as processing and prevention of aggregation in mitochondria.