Histochemische, molekularpathologische und mikrobiologische Diagnostik typischer und atypischer Mykobakterien an Paraffin-eingebetteten Gewebeproben

Abstract

Einleitung: Die Tuberkulose gehört nach wie vor zu den häufigsten Infektionskrankheiten weltweit und ist auch in Deutschland im Zuge der Flüchtlingswelle wieder aktuell. <br /> Zielsetzung: Die überwiegende Mehrheit der Fachliteratur befasst sich mit der Auswertung der mikrobiologischen Diagnostik von Mykobakteriosen an Sputumproben. Die vorliegende Studie vergleicht erstmalig den histo- und molekularpathologischen Nachweis von Mykobakteriosen an Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeproben. <br /> Methode: Anhand eines Patientenkollektivs von insgesamt 1234 Patienten im fortlaufenden Routineeingang zwischen 2000 – 2017 des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Bonn mit einem histomorphologischen Verdacht auf eine Mykobakteriose wurden die Sensitivität, Spezifität und Kosteneffektivität der histochemischen Färbemethoden (HE-, Ziehl-Neelsen- und Auramin-Färbung) bei molekularpathologischen Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken als Referenzstandard ermittelt. Hierbei wurde unterschieden zwischen dem gemischten Personal der Fachpathologen, i.e. Assistenz-/Fach-/Oberarzt (Primärbefunder) und langjährig erfahrener Pathologe (Sekundärbefunder). <br /> Ergebnisse: Bei den molekularpathologisch positiven Tuberkulose-Fällen lag in 59,3 % der Fälle eine epitheloidzellig-granulomatöse Entzündung mit Nekrosen vor. Die Auramin-Färbung hatte eine signifikant höhere Sensitivität als die Ziehl-Neelsen-Färbung (Primär-/Sekundärbefunder: 49,7 % / 57,9 % vs. 27,7 % / 25,5 %). Die Ziehl-Neelsen-Färbung hatte eine leicht höhere Spezifität als die Auramin-Färbung (Primär-/Sekundärbefunder: 93,3 % / 94,0 % vs. 87 % / 87,5 %). Im direkten Vergleich zwischen Primär- und Sekundärbefunder an denselben Schnitten war die Sensitivität des Sekundärbefunders bezüglich der Auramin-Färbung um 13 % höher (65,2 % vs. 52,2 %). Die Kombination der beiden Färbetechniken führte zu einer Gesamt-Sensitivität von 50,8 % bei einer Spezifität von 87,1 %. Hier ergab sich eine Erhöhung der Sensitivität im Gegensatz zur alleinigen Sensitivität der Ziehl-Neelsen-Färbung von 23,1 % bei zu vernachlässigender Verringerung der Spezifität. Unter 48 (10,9 %) histopathologisch positiven aber molekularpathologisch negativ gewerteten Fällen konnte bei 18 Fällen durch Hinzunahme mikrobiologischer Untersuchungsergebnisse nachgewiesen werden, dass die molekularpathologischen Ergebnisse falsch negativ waren (falschnegative Fallzahl 4,1 %). <br /> Fazit: Die Mikroskopie ist auch in Deutschland immer noch das kostengünstigste und schnellste Verfahren in der Diagnostik der Mykobakterien. Das Vorliegen einer epitheloidzellig-granulomatösen Entzündung mit Nekrosen ist hierbei ein valider Hinweis auf eine Infektion mit einer Mykobakteriose. Dabei hat diese Studie einmal mehr gezeigt, dass die Auramin-Färbung der Ziehl-Neelsen-Färbung auch bei Gewebeproben in Bezug auf die Sensitivität deutlich überlegen war, jedoch andersherum die Ziehl-Neelsen-Färbung eine leicht höhere Spezifität als die Auramin-Färbung aufwies (Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken als Referenzstandard). Zusätzlich konnte die Auramin-Färbung etwas schneller ausgewertet werden, was eine Zeitreduktion und folglich eine Kostenreduktion mit sich bringt. Bei imperfektem Referenzstandard zeigt sich einmal mehr, dass eine Kombination der Färbungen mit Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken die schnellstmögliche und sicherste Möglichkeit einer schnellen Diagnostik der Mykobakteriosen darstellt. Die mikrobiologische Kultur ist zwar nach wie vor der absolute Goldstandard in der Diagnostik der Mykobakteriosen, dauert jedoch bei einer akuten klinischen Symptomatik einfach zu lange, bis zum notwendigen Therapiebeginn.

<strong>Histochemical, molecular pathological and microbiological diagnosis of typical and atypical mycobacteria on paraffin-embedded tissue samples </Strong> <br /> Introduction: Tuberculosis is still one of the leading infectious diseases worldwide. It gained new relevance in Germany due to the current wave of refugees. <br /> Objectives: The majority of studies deals with the evaluation of microbiological diagnostics of mycobacteria on sputum samples. For the first time, this study compares the histo- and molecular pathological detection of mycobacteria on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples. <br /> Materials and methods: The sensitivity, specificity and cost-effectiveness of the histochemical staining methods (Haematoxylin Eosin, Ziehl-Neelsen and Auramine staining) were examined ona patient collective of 1234 patients in the continuous routine entrance between 2000 - 2017 of the Institute for Pathology at the University Hospital Bonn. Molecular pathological nucleic acid amplification techniques were taken as reference method. A distinction was made between the mixed staff of pathologists in the hospital, i.e. assistant/ specialist/ senior physician (primary assessor) and a pathologist with many years of experience (secondary assessor). <br /> Results: Concerning the molecular pathologically positive tuberculosis cases, epitheloid cell granulomatous inflammation with necrosis was present in 59.3% of the cases. Auramine staining had a significantly higher sensitivity than Ziehl-Neelsen staining (primary / secondary assessor: 49.7% / 57.9% vs. 27.7% / 25.5%). The Ziehl-Neelsen staining had a slightly higher specificity than the Auramine staining (primary / secondary assessor: 93.3% / 94.0% vs. 87% / 87.5%). In a direct comparison between primary and secondary assessor on the same slices, the sensitivity of the secondary assessor regarding Auramine staining was significantly higher (13%; 65.2% vs. 52.2%). The combination of the two staining techniques resulted in an overall sensitivity of 50.8% with a specificity of 87.1%. In combination there was an increase in sensitivity in contrast to the sole sensitivity of the Ziehl-Neelsen stain of 23.1% with an insignificant decrease in specificity. In 48 (10.9 %) cases, which were diagnosed as histopathologically positive but molecular pathologically negative, we found 18 cases to be falsely molecular pathologically negative, using additive microbiological testing methods such as culture (false negative number of cases 4.1%). <br /> Conclusion: Microscopy is still the cheapest and fastest method in the diagnosis of mycobacteria. Using this method, the presence of epitheloid cell granulomatous inflammation with necrosis is valid evidence of an infection with mycobacteriosis. Comparing sputum and tissue samples, this study revealed that the Auramine staining was also significantly superior to the Ziehl-Neelsen staining in tissue samples in terms of sensitivity. On the other hand, the Ziehl-Neelsen staining had a slightly higher specificity than the Auramine staining (Nucleic acid amplification techniques as a reference standard). But the Auramine staining could be examined faster, which means a reduction in time and consequently a reduction in costs. Conclusionally the combination of the microscopic stains with nucleic acid amplification techniques is the fastest way of correctly diagnosing mycobacteriosis. The microbiological culture is still the absolute gold standard in the diagnosis of mycobacteriosis, however, in case of acute clinical symptoms it takes too long to wait for the results before the necessary initiation of therapy.