Transient Heme-Protein Interactions: Structural and Functional Studies on Interleukin-36α and Amyloid-β

Abstract

The porphyrin heme is primarily known as a pivotal blood component. As functional part of hemoglobin, heme is responsible for the blood’s vibrant red color and enables the transport of oxygen within the body. Moreover, biologically available heme acts as an effector and signaling molecule. As such, heme alters the activity and/or stability of proteins or evokes the formation of catalytically active complexes via transient heme-protein interactions. The latter was first observed for Amyloid beta (Aβ), whose aberrant accumulation is a hallmark of Alzheimer’s disease (AD). Elevated heme levels are increasingly discussed in the context of assorted pathological conditions, such as inflammation and malaria as well as AD. Yet, intra- and extracellular heme concentrations are largely unknown due to the lack of suitable quantification methods. Within the scope of this work, a test system based on the catalytic activity of hemepeptide complexes was established to quantify biologically available heme in patient samples, such as <em>Liquor cerebrospinalis</em> (CSF). Beyond this, a potential interaction of heme with the proinflammatory cytokine interleukin-36α (IL-36α) was investigated. <br /> Initially, a selection of heme-peptide complexes was examined with regard to their catalytic activity. A heme-binding 23mer peptide proved to be superior to Aβ and highly suitable for the application in a heme quantification assay. Subsequent studies with human CSF verified the correlation between substrate conversion and heme concentration. Heme binding to Aβ was characterized in more detail and the possible interplay between heme, the lipoprotein LDL, and Aβ, as it might occur in AD, was analyzed. Besides, a potential heme interaction with the proinflammatory cytokine IL-36α was subject of investigation. By means of different protein mutants and various spectroscopic methods, the binding of two heme molecules to distinct sequence motifs in IL-36α was confirmed. Structural analysis of the cytokine by 3D NMR spectroscopy provided detailed insights into the molecular basis of the hemeprotein interaction. Furthermore, studies with fibroblast-like synoviocytes (FLS) isolated from knee joints of patients with rheumatoid arthritis revealed that heme binding to IL-36α as well as to IL-36β and IL-36γ attenuates IL-36 signaling. <br /> The presented studies on the quantification of heme in patient samples and on the potentially heme-regulated protein IL-36α broaden the existing knowledge on the role of heme as an effector and signaling molecule in medical conditions. Hence, the findings contribute to the general disease understanding as well as to future development of therapy strategies.

Das Porphyrin Häm ist vor allem als zentrale Komponente des Bluts bekannt. Als funktioneller Bestandteil des Hämoglobins verleiht es dem Blut seine leuchtend rote Farbe und ermöglicht den Transport von Sauerstoff innerhalb des Körpers. Darüber hinaus fungiert biologisch verfügbares Häm als Effektor- und Signalmolekül. Als solches beeinflusst Häm durch transiente Häm-Protein-Interaktionen die Aktivität und/oder Stabilität von Proteinen oder verursacht die Bildung katalytisch aktiver Komplexe. Letzteres wurde erstmals für Amyloid beta (Aβ) beobachtet, dessen aberrante Akkumulation ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist. Erhöhte Hämspiegel werden zunehmend im Kontext mit verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Entzündungen und Malaria sowie der Alzheimer-Krankheit, diskutiert. Dennoch sind intra- und extrazelluläre Häm-Konzentrationen mangels geeigneter Quantifizierungsmethoden weitgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Testsystem basierend auf der katalytischen Aktivität von Häm-Peptid-Komplexen etabliert, um biologisch verfügbares Häm in Patientenproben, wie <em>Liquor cerebrospinalis</em> (CSF), zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde eine mögliche Interaktion von Häm mit dem proinflammatorischen Zytokin Interleukin-36α (IL-36α) untersucht. <br /> Zunächst wurde eine Auswahl von Häm-Peptid-Komplexen hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität analysiert. Ein Häm-bindendes 23mer-Peptid zeigte größeres Potential als Aβ und erwies sich für die Anwendung in einem Quantifizierungssystem als geeignet. Nachfolgende Studien mit humanem Liquor bestätigten die Korrelation zwischen Substratumsetzung und Hämkonzentration. Die Häm-Bindung an Aβ wurde weiter charakterisiert und eine mögliche Wechselwirkung zwischen Häm, dem Lipoprotein LDL und Aβ, wie sie bei der Alzheimer-Erkrankung auftreten kann, wurde untersucht. Darüber hinaus war eine potentielle Häm-Interaktion mit dem proinflammatorischen Zytokin IL-36α Gegenstand der Untersuchung. Mit Hilfe verschiedener Proteinmutanten und unterschiedlicher spektroskopischer Methoden wurde die Bindung von zwei Häm-Molekülen an unterschiedliche Sequenzmotive in IL-36α bestätigt. Die strukturelle Analyse des Zytokins mittels 3D-NMR-Spektroskopie lieferte detaillierte Einblicke in die molekularen Grundlagen der Häm-Protein-Interaktion. Des Weiteren zeigten Studien mit fibroblastenartigen Synoviozyten (FLS), die aus den Kniegelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis isoliert wurden, dass die Hämbindung an IL-36α sowie an IL-36β und IL-36γ die IL-36-vermittelte Signalübertragung verringert. <br /> Die dargelegten Studien zur Quantifizierung von Häm in Patientenproben und zum potenziell Häm-regulierten Protein IL-36α erweitern das vorhandene Wissen über die Rolle von Häm als Effektor- und Signalmolekül in Erkrankungen. Die Ergebnisse tragen so zum allgemeinen Krankheitsverständnis und zur zukünftigen Entwicklung von therapeutischen Strategien bei.