Rationales Design und Aufbau DNA- und Fluorophor-markierter chemischer Sonden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

Abstract

Die vorliegende Dissertation umfasst die Synthese von Wirkstoff-Molekülen sowie fluoreszenzmarkierten und Oligonukleotid-gebundenen Wirkstoffen, die als Sonden zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), Adenosinrezeptoren (AR) und Dopaminrezeptoren (DR) eingesetzt werden bzw. wurden. <br /> Das Hauptthema der Arbeit sind chemische Beiträge zur Entwicklung eines neuartigen Assays, basierend auf dem Proximity Ligation Assay (PLA). Dieser auf Antikörper-Oligonukleotid-Addukten basierende Assay ermöglicht die Detektion und Lokalisation von Proteinen und Protein-Protein-Interaktionen im natürlichen Gewebe. Mein Ziel war der Austausch der Antikörper gegen small molecules unter Aufrechterhaltung der Assayfunktionalität. Hierfür wurde ein Baukasten-Konzept entwickelt, welches die Kombination von Wirkstoff, Linkern und Oligonukleotid zulässt. <br /> Als erster Baustein wurde für jeden Rezeptor ein Antagonist ausgewählt und mit einer funktionellen Gruppe versehen. Als Brückenelemente wurden bifunktionalisierte Polyethylenglykol-(PEG)-Linker mit 4 – 20 Einheiten hergestellt und mit dem ersten Baustein, dem Rezeptor-Antagonisten verknüpft. Die erhaltenen Addukte wurden auf ihre Bindungseigenschaften hin untersucht, um so die optimale Linkerlänge zu ermitteln. Nach Anknüpfen eines Nukleosids, als Proof of Principle, wurde die Synthese der Oligonukleotid-gebundenen Sonden an der Festphase abgeschlossen. Die acht erhaltenen Sonden befinden sich zurzeit in der biologischen Testung. <br /> Aufgrund des Baukasten-Konzepts wurde ein System geschaffen werden, welches die Anknüpfung weiterer funktioneller Einheiten, wie zum Beispiel von Fluorophoren ermöglicht. So konnten Fluorophor-gebundene Sonden für A1AR, A2AAR, A3AR und D2DR und erhalten werden. Diese hoch affinen und selektiven Sonden ermöglichen die Untersuchung von Rezeptoren im Wellenlängenbereich von 450 – 700 nm. <br /> Der speziell für den A3AR neu entwickelte Ligand wurde durch einen bioinformatischen Ansatz erhalten, bei dem automatisiert generierte Rezeptormodelle mit einer Bibliothek an Liganden kombiniert und bewertet wurden. Daraus wurde der beste Ligand und dessen Orientierung ermittelt und in einer 5-stufigen Synthese, darunter eine Rh-katalysierte CH-Aktivierung, erhalten. <br /> Im Rahmen eines Kooperationsprojekts wurden Mizellen mit einem der erhaltenen Ligand-Linker-Addukte funktionalisiert, welche später im Bereich der gezielten Immuntherapie von Krebs Anwendung finden sollen. Dieser als Drug Targeting bekannte Ansatz soll eine zielgerichtete Wirkung ohne systemische Nebenwirkungen ermöglichen. <br /> Schließlich wurden einzelne Bausteine des Baukastens für Co-Kristallisationsexperimente mit Adenosinrezeptoren bereitgestellt. Dabei konnte bereits eine erste Röntgenkristallstruktur des humanen A2A-Adenosinrezeptors im Komplex mit einem von mir hergestellten PEG-Linker-verknüpften A2A-Adenosinrezeptor Antagonisten mit trizyklischer Struktur erhalten werden. <br /> Die vorliegende Arbeit legt den Grundstein für ein innovatives, modulares Konzept aus Ligand, Linker und funktioneller Einheit und bietet zukünftig eine breite Auswahl an Kombinationsmöglichkeiten, die zur Erforschung von Rezeptoren und Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen sowie assoziierter Krankheiten genutzt werden kann.