Influence of disulfide-bonds on structural and functional properties of peptides and proteins - Case studies on FXIIIa inhibitor tridegin and µ-conotoxin PIIIA

Abstract

Disulfide-bonded peptides have been studied for many decades serving as tools to investigate various biochemical pathways as well as lead structures for drug development for numerous diseases. Among these, the most fatal are cardiovascular diseases, triggered by dysregulated haemostasis. An essential component of the haemostasis is the blood coagulation cascade, involving the formation of a fibrin network, thereby stabilizing the blood clot. In addition to the central enzyme thrombin, the blood coagulation factor FXIII has a decisive role, as it cross-links the fibrin network and hence stabilizes it. FXIII is thus an attractive target for the development of therapeutically relevant anticoagulants. One of the most promising compounds for inhibiting FXIII activity is the 66mer leech-derived peptide tridegin, which is structurally stabilized by three disulfide bonds. Recent studies focused on the impact of these three disulfide bonds on the structure and function of tridegin. Similar investigations have been carried out earlier for the 15 3-disulfide-bonded µ-conotoxin PIIIA (µ-PIIIA) isomers, that displayed different biological activity towards voltage-gated sodium ion channels. Both studies revealed a significant influence of the disulfide bond connectivity on the functional effectiveness of these peptides encouraging further investigations.<br /> The present dissertation focuses on both these topics providing deeper insights into chemosynthetic, bioanalytical, and biological aspects of the differentially disulfide-linked tridegin and µ-PIIIA variants. First, all 2-disulfide-bonded tridegin analogs deficient in the bond between Cys19 and Cys25 of the native lead structures were synthesized as well as chemically and biologically analyzed. These investigations revealed that the aforementioned disulfide bond is not as crucial for the inhibitory potential towards FXIIIa as supposed. In addition, one of the 2-disulfide-bonded tridegin variants was examined structurally via experimental and computer-based analyses. In this context, the structure of a tridegin analog was determined by NMR-based structural analysis for the first time. The drastic reduction of the synthesis complexity, compounded by the marked retention of inhibitory activity of the disulfide-deficient isomers poise them as attractive candidates as lead structures for therapeutic anticoagulant development.<br /> In a second study of this dissertation, the applicability of LC-TIMS-MS for the discrimination of isomers with different disulfide bond connectivities was examined using ten different µ-PIIIA isomers and analogs. Therefore, the LC and TIMS profiles of pure peptide samples as well as mixtures of three 2- and seven 3-disulfide-bonded variants were compared. This analysis demonstrated that LC-TIMS-MS is a valuable supplement to the commonly used methods HPLC and MS to distinguish different 2- and 3-disulfide-bonded peptide isomers.<br /> In summary, this dissertation provides new insights into the structure-activity relationships of tridegin and serves as a basis for the development of new anticoagulants. Furthermore, it uncovers a methodologically underexplored territory, presenting the suitability of LC-TIMS-MS for the differentiation of peptide isomers with distinct disulfide bond connectivities.

<strong>Einfluss von Disulfidbrücken auf strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Peptiden und Proteinen - Fallstudien zu dem FXIIIa Inhibitor Tridegin und dem µ-Conotoxin PIIIA</strong><br /> Disulfidverbrückte Peptide werden schon seit vielen Jahrzehnten untersucht und dienen als chemisches Werkzeug in der Erforschung verschiedener biochemischer Abläufe und als Leitstruktur für die Entwicklung von Medikamenten in zahlreichen Krankheiten. Die am häufigsten zum Tode führenden Krankheiten sind dabei die kardiovaskulären Erkrankungen, die durch eine dysregulierte Hämostase ausgelöst werden können. Ein wesentlicher Bestandteil der Hämostase ist die Blutgerinnungskaskade, die zur Ausbildung eines Fibrinnetzwerkes führt und darüber das Blutgerinnsel stabilisiert. Neben dem zentralen Enzym Thrombin, spielt der Blutgerinnungsfaktor FXIII eine entscheidende Rolle, da dieser das Fibrinnetzwerk quervernetzt und zusätzlich stabilisiert. FXIII ist daher eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung von therapeutisch relevanten Antikoagulantien. Eines der vielversprechendsten Substanzen zur Hemmung der FXIII-Aktivität ist das 66 Aminosäure lange Peptid Tridegin, welches strukturell durch drei Disulfidbrücken stabilisiert wird. Jüngste Tridegin-Studien untersuchten dabei den Einfluss dieser drei Disulfidbrücken auf die Struktur und Funktion dieses Peptides. Dasselbe wurde bereits für die 15 dreifach disulfid-verbrückten Isomere des µ-Conotoxin PIIIA (µ-PIIIA) durchgeführt, wobei die Isomere unterschiedliche biologische Aktivitäten gegenüber spannungsgesteuerter Natriumionenkanäle zeigten. Beide Studien offenbarten einen wesentlichen Einfluss der Disulfidverbrückung auf die funktionellen Eigenschaften dieser Peptide, was zu weiteren Untersuchungen anregte.<br /> Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit den beschriebenen Themen, um weitere Einblicke in die chemosynthetischen, bioanalytischen und biologischen Aspekte unterschiedlicher disulfidverbrückter Tridegin- bzw. µ-PIIIA-Analoga zu erhalten. Dabei sollten im ersten Teil dieser Arbeit alle zweifach disulfidverbrückten Tridegin-Analoga, ohne die in den nativen Leitstrukturen enthaltende Bindung zwischen Cys19 und Cys25, hergestellt und chemisch sowie biologisch analysiert werden. Die entsprechenden Untersuchungen ergaben, dass die erwähnte Disulfidbrücke nicht so entscheidend für das inhibitorische Potential gegenüber FXIIIa ist. Darüber hinaus wurde eine zweifach disulfidverbrückte Trideginvariante mit Hilfe von experimentellen und computerbasierten Analysen strukturell untersucht. In diesem Zusammenhang konnte erstmals über NMR-basierte Strukturaufklärung die Struktur eines Tridegin-Analogons experimentell ermittelt werden. Aufgrund der vereinfachten Synthese der disulfidreduzierten Isomere, die zeitgleich eine gleichbleibende inhibitorische Aktivität gegenüber FXIIIa beibehielten, dürfte die neue Leitstruktur von Tridegin für die zukünftige Entwicklung von Antikoagulantien sehr geeignet sein.<br /> In einer zweiten Studie dieser Dissertation wurde die Anwendbarkeit von LC-TIMS-MS zur Unterscheidung von Isomeren mit unterschiedlicher Disulfidverbrückung anhand von 10 verschiedenen µ-PIIIA-Varianten untersucht. Dafür wurden die LC- und TIMS-Profile der reinen Peptidproben sowie der Mischungsexperimente von 3 zweifach und 7 dreifach disulfidverbrückten Varianten verglichen. Mittels dieser Analyse konnte gezeigt werden, dass LC-TIMS-MS eine wertvolle Ergänzung zu den üblicherweise verwendeten Methoden HPLC und MS zur Unterscheidung verschiedener disulfidverbrückter Peptidisomere darstellt.<br /> Zusammenfassend bietet diese Dissertation neue Einblicke in die Struktur-Aktivitäts Beziehungen von Tridegin und dient als Grundlage für die Entwicklung neuer Antikoagulanzien. Darüber hinaus liefert sie einen ersten Hinweis auf die nützliche Anwendbarkeit von LC-TIMS-MS zur Differenzierung von Peptidisomeren mit unterschiedlicher Disulfidverbrückung.