Selection of an aptamer and development of a genetic device to control mRNA stability in response to light

Abstract

Artificial autocatalytic RNA molecules, so-called aptazymes, are utilized as genetic devices to study and influence biological processes. These genetic devices consist of the autocatalytic RNA part, the ribozyme, and a ligand-sensing part, called aptamer. Most of these devices use small molecule ligands as a trigger to regulate the cleavage activity of the aptazyme. However, the utility of small molecules has some limitations such as potential side effects, lack of reversibility as well as limited spatial and temporal control. In contrast, visible light as a trigger has the advantage of being reversible, non-harmful, and spatially and temporally controllable. Ribozymes per se, however, have no intrinsic ability to sense light. But in the field of optogenetics, proteins with LOV domains act as light-sensitive sensors. Herein, optogenetics was combined with aptamer technology to develop a genetic device capable of regulating mRNA stability in response to light. In a rational design approach, an aptamer that can bind the LOV protein PAL was fused to the hammerhead ribozyme. The aptazyme exhibited light-dependent cleavage activity, which could be modulated by varying the stem length of the introduced aptamer. This concept created aptazymes that exhibited decreased or increased cleavage activity in the presence of light. This discovery paves the way for the utilization of this system in the field of synthetic biology or basic research.

Künstliche autokatalytische RNA-Moleküle, so genannte Aptazyme, werden als genetische Werkzeuge zur Untersuchung und Beeinflussung biologischer Prozesse eingesetzt. Diese genetischen Werkzeuge bestehen aus dem autokatalytischen RNA-Teil, dem Ribozym, und einem ligandensensitiven Teil, dem Aptamer. Die meisten dieser Werkzeuge verwenden niedermolekulare Liganden als Auslöser, um die Spaltungsaktivität des Aptazyms zu regulieren. Die Verwendung niedermolekularer Liganden hat jedoch einige Limitationen, beispielsweise potenzielle Nebenwirkungen, mangelnde Reversibilität sowie begrenzte räumliche und zeitliche Kontrolle. Im Gegensatz dazu hat sichtbares Licht als Auslöser den Vorteil, dass es reversibel, nicht schädlich und räumlich und zeitlich kontrollierbar ist. Ribozyme als solche besitzen nicht die intrinsische Fähigkeit, Licht zu perzipieren. Im Bereich der Optogenetik fungieren Proteine mit LOV-Domänen jedoch als lichtempfindliche Sensoren. In diesem Projekt wurde die Optogenetik mit der Aptamer-Technologie kombiniert, um ein genetisches Werkzeug zu entwickeln, das die mRNA-Stabilität als Reaktion auf Licht regulieren kann. In einem rationalen Designansatz wurde ein Aptamer, das das LOV-Protein PAL binden kann, mit dem Hammerhead-Ribozym fusioniert. Das Aptazym zeigte eine lichtabhängige Spaltungsaktivität, die durch Variation der Stammlänge des angebundenen Aptamers moduliert werden konnte. Mit diesem Konzept wurden Aptazyme geschaffen, die in Gegenwart von Licht eine verringerte oder erhöhte Spaltaktivität aufweisen. Diese Entdeckung ebnet den Weg für die Nutzung dieses Systems im Bereich der synthetischen Biologie oder für die Grundlagenforschung.