Charakterisierung von Anti-FVIII-Antikörpern: Multiplex-Luminex-Analyse in der erworbenen und kongenitalen Hämophilie A

Abstract

<strong>Hintergrund:</strong> Die Bildung von Antikörpern gegen Gerinnungsfaktor VIII (FVIII) stellt sowohl bei der angeborenen als auch bei der erworbenen Hämophilie A eine der bedeutendsten immunologischen Komplikationen dar. Während Alloantikörper die Wirksamkeit der FVIII-Substitutionstherapie erheblich beeinträchtigen, führen Autoantikörper bei der erworbenen Hämophilie A zu einer potenziell lebensbedrohlichen Blutungsneigung. <br/>

<strong>Zielsetzung:</strong> Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines neuartigen multiplexen Immunoassays für das umfassende Profiling von Anti-FVIII-Antikörpern sowie dessen Anwendung zur vergleichenden Charakterisierung der humoralen Anti-FVIII-Immunantwort bei der angeborenen und erworbenen Hämophilie A. <br/>

<strong>Methoden:</strong> Hierfür wurde der Luminex-basierte Multiplex-Immunoassay LumiTope entwickelt, der die simultane Analyse von Anti-FVIII-Antikörpern hinsichtlich ihrer Domänenspezifität sowie ihrer Immunglobulin-Isotypen und -Subklassen ermöglicht. Nach analytischer und diagnostischer Validierung in einer großen Kohorte von Patienten mit angeborener Hämophilie A wurde der Assay bei Patienten mit erworbener Hämophilie A eingesetzt und die Antikörperprofile mit klinischen und laborchemischen Parametern korreliert. <br/>

<strong>Ergebnisse:</strong> Der LumiTope-Assay zeigte eine hohe diagnostische Sensitivität (94,9 %) und Spezifität (91,2 %) zur Detektion von Anti-FVIII-Antikörpern und war insbesondere bei niedrig-titrigen Inhibitoren (Sensitivität: 72,2 % vs. 27,7 %) einem kommerziellen ELISA deutlich überlegen. Mit der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein Multiplex-Immunoassay etabliert, der die simultane Analyse des vollständigen domänenspezifischen Anti-FVIII-Antikörperrepertoires ermöglicht. Hierdurch konnten krankheitsspezifische Antikörpersignaturen identifiziert sowie funktionelle Unterschiede zwischen neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Anti-FVIII-Antikörpern aufgezeigt werden. Neutralisierende Antikörper richteten sich bevorzugt gegen die funktionell relevanten A2- und C1C2-Domänen, während nicht-neutralisierende Antikörper überwiegend die A1- und B-Domäne erkannten. Darüber hinaus zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen beiden Erkrankungen: Während bei Patienten mit angeborener Hämophilie A überwiegend Antikörper gegen die A2-Domäne nachgewiesen wurden, dominierte bei Patienten mit erworbener Hämophilie A die Immunantwort gegen die C1C2-Domäne. Bei beiden Erkrankungen stellte IgG4 die dominierende Antikörpersubklasse dar, welche signifikant mit der Inhibitorstärke korrelierte. IgM-Antikörper wurden bei 17,5 % der erworbenen Hämophilie A Patienten nachgewiesen und waren mit einer erhöhten Mortalität assoziiert (33 % vs. 16 %). <br/>

<strong>Schlussfolgerung:</strong> Mit dieser Arbeit wurde erstmals ein standardisierter Multiplex-Immunoassay für das umfassende domänenspezifische Profiling von Anti-FVIII-Antikörpern entwickelt und klinisch validiert. Die Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse zur funktionellen Immunpathophysiologie der Anti-FVIII-Immunantwort und zeigen Unterschiede in der domänenspezifischen Antikörpererkennung zwischen der angeborenen und der erworbenen Hämophilie A auf. Damit schaffen sie eine Grundlage für die Weiterentwicklung diagnostischer Verfahren, eine präzisere Risikostratifizierung sowie die Entwicklung personalisierter Therapieansätze.

<strong>Background:</strong> The development of antibodies against coagulation factor VIII (FVIII) represents one of the most significant immunological complications in both congenital and acquired haemophilia A. While alloantibodies substantially compromise the efficacy of FVIII replacement therapy in congenital haemophilia A, autoantibodies in acquired haemophilia A result in potentially life-threatening bleeding. <br/>

<strong>Objective:</strong> The aim of this thesis was to develop and validate a novel multiplex immunoassay for comprehensive anti-FVIII profiling and to apply this platform for the comparative characterization of the humoral anti-FVIII immune response in congenital and acquired haemophilia A. <br/>

<strong>Methods:</strong> A Luminex-based multiplex immunoassay (LumiTope) was developed to enable the simultaneous characterization of anti-FVIII antibodies with respect to their domain specificity as well as their immunoglobulin isotypes and subclasses. Following analytical and diagnostic validation in a large cohort of patients with congenital haemophilia A, the assay was applied to patients with acquired haemophilia A to investigate associations between antibody profiles and clinical as well as laboratory parameters. <br/>

<strong>Results:</strong> The LumiTope assay demonstrated high diagnostic sensitivity (94.9%) and specificity (91.2%) for the detection of anti-FVIII antibodies and outperformed a commercially available ELISA, particularly in patients with low-titre inhibitors (Sensitivity: 72.2% vs. 27.7%). This work establishes the first multiplex immunoassay enabling simultaneous profiling of the complete domain-specific anti-FVIII antibody repertoire. The assay identified disease-specific antibody signatures and revealed functional differences between neutralizing and non-neutralizing anti-FVIII antibodies. Neutralizing antibodies preferentially targeted the functionally relevant A2 and C1C2 domains, whereas non-neutralizing antibodies predominantly recognized the A1 and B domains. Furthermore, distinct disease-specific differences in domain specificity were observed: antibodies from patients with congenital haemophilia A were predominantly directed against the A2 domain, whereas the immune response in acquired haemophilia A primarily targeted the C1C2 domain. IgG4 represented the predominant antibody subclass in both diseases and correlated significantly with inhibitor titres. IgM antibodies were detected in 17.5% of patients with acquired haemophilia A and were associated with increased mortality (33% vs. 16%). <br/>

<strong>Conclusions:</strong> This work establishes and clinically validates the first standardized multiplex immunoassay for comprehensive domain-specific anti-FVIII profiling. The results provide novel insights into the functional immunopathophysiology of anti-FVIII immune responses and highlight disease-specific differences in domain-specific antibody recognition between congenital and acquired haemophilia A. Together, these findings provide a foundation for improved diagnostic strategies, more precise risk stratification, and the development of personalized therapeutic approaches.