Die Metachromatische Leukodystrophie (MLD) wird verursacht durch eine funktionelle Defizienz des metabolischen Enzyms Arylsulfatase A (ARSA). Unter physiologischen Bedingungen baut ARSA das Membranlipid 3'-O-Sulfo-Galaktosylceramid (Sulfatid) im Lysosom ab. In MLD-Patienten wird Sulfatid nicht degradiert und akkumuliert überwiegend in den myelinbildenden Zellen des Nervensystems, den Oligodendrozyten und Schwann-Zellen. Das führt zu einer Demyelinisierung und zu schwerwiegenden neurologischen Symptomen. Bislang sind die zugrunde liegenden Pathomechanismen unzureichend geklärt. Ein in vitro-Modell, welches den Phänotyp der Krankheit widerspiegelt, kann neue Erkenntnisse über die Krankheitsmechanismen liefern. Das neu entwickelte Verfahren, induziert pluripotente Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPSC) herzustellen, bietet die Möglichkeit, aus somatischen Zellen patientenspezifische Kultursysteme zu generieren. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden Hautfibroblasten von vier MLD-Patienten mit distinkten Mutationen im ARSA-Gen erfolgreich mit Hilfe von nicht-integrierenden Sendaiviren in iPSCs reprogrammiert. Anschließend wurden die vollständig validierten MLD-spezifischen iPSCs in radialgliaähnliche neurale Vorläuferzellen (radial glia-like neural precursor cells, RGL-NPC) differenziert. Diese sind multipotent und konnten nach Entzug der Wachstumsfaktoren in Astrozyten, Neurone und Oligodendrozyten differenziert werden. Eine ARSA-Enzymaktivitätsmessung bestätigte die funktionelle Defizienz des Enzyms in den MLD-RGL-NPCs sowie deren ausdifferenzierten neuralen Subtypen. In den untersuchten Differenzierungsstadien der MLD-abgeleiteten Oligodendrozyten konnten im Vergleich zu Kontrollzellen sowohl bei der Ablagerung von Sulfatid als auch in der Morphologie und im Differenzierungsverhalten der Zellen kein Unterschied festgestellt werden.<br /> Zusätzlich wurde in den ARSA-defizienten RGL-NPCs die Aufnahme von exogener ARSA studiert. Die Verabreichung von ARSA führte in den MLD-spezifischen Zellen zu einer Wiederherstellung der intrazellulären ARSA-Enzymaktivität. Die MLD-RGL-NPCs eignen sich somit als humanes neurales in vitro-Kultursystem, um die Mechanismen der ARSA-Aufnahme und die intrazelluläre ARSA-Aktivität zu studieren, sowie mögliche Wirkstoffe, die diese Prozesse beeinflussen können, zu evaluieren.<br /> Um die Funktionalität sowie mögliche Sulfatidakkumulationen und Myelinisierungsdefekte in den MLD-abgeleiteten Oligodendrozyten in vivo zu untersuchen, wurden die Zellen in ein krankheitsspezifisches Milieu eingebracht. Hierfür wurde ein Mausmodell generiert, welches die ARSA-Defizienz mit einer Myelin-Defizienz kombiniert. Mit Hilfe histologischer Analysen konnten prominente Sulfatidablagerungen besonders in den myelindefizienten faserreichen Strukturen des Gehirns demonstriert werden. Erste Transplantationsstudien in neonatale Mäuse zeigten, dass die RGL-NPCs für mindestens 8 Wochen überlebten, sich in das Empfängergewebe integrierten und in gliale Subtypen differenzierten. Die transplantierten Zellen waren in der Lage, MBP-positive Oligodendrozyten zu bilden. Dieses Xenotransplantat-Modell kann Aufschluss über mögliche oligodendrogliale Fehlfunktionen im Zusammenhang mit der ARSA-Defizienz und den Sulfatidablagerungen geben....

Die Metachromatische Leukodystrophie (MLD) wird verursacht durch eine funktionelle Defizienz des metabolischen Enzyms Arylsulfatase A (ARSA). Unter physiologischen Bedingungen baut ARSA das Membranlipid 3’-O-Sulfo-Galaktosylceramid (Sulfatid) im Lysosom ab. In MLD-Patienten wird Sulfatid nicht degradiert und akkumuliert überwiegend in den myelinbildenden Zellen des Nervensystems, den Oligodendrozyten und Schwann-Zellen. Das führt zu einer Demyelinisierung und zu schwerwiegenden neurologischen Symptomen. Bislang sind die zugrunde liegenden Pathomechanismen unzureichend geklärt. Ein in vitro-Modell, welches den Phänotyp der Krankheit widerspiegelt, kann neue Erkenntnisse über die Krankheitsmechanismen liefern. Das neu entwickelte Verfahren, induziert pluripotente Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPSC) herzustellen, bietet die Möglichkeit, aus somatischen Zellen patientenspezifische Kultursysteme zu generieren. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden Hautfibroblasten von vier MLD-Patienten mit distinkten Mutationen im ARSA-Gen erfolgreich mit Hilfe von nicht-integrierenden Sendaiviren in iPSCs reprogrammiert. Anschließend wurden die vollständig validierten MLD-spezifischen iPSCs in radialgliaähnliche neurale Vorläuferzellen (radial glia-like neural precursor cells, RGL-NPC) differenziert. Diese sind multipotent und konnten nach Entzug der Wachstumsfaktoren in Astrozyten, Neurone und Oligodendrozyten differenziert werden. Eine ARSA-Enzymaktivitätsmessung bestätigte die funktionelle Defizienz des Enzyms in den MLD-RGL-NPCs sowie deren ausdifferenzierten neuralen Subtypen. In den untersuchten Differenzierungsstadien der MLD-abgeleiteten Oligodendrozyten konnten im Vergleich zu Kontrollzellen sowohl bei der Ablagerung von Sulfatid als auch in der Morphologie und im Differenzierungsverhalten der Zellen kein Unterschied festgestellt werden.<br /> Zusätzlich wurde in den ARSA-defizienten RGL-NPCs die Aufnahme von exogener ARSA studiert. Die Verabreichung von ARSA führte in den MLD-spezifischen Zellen zu einer Wiederherstellung der intrazellulären ARSA-Enzymaktivität. Die MLD-RGL-NPCs eignen sich somit als humanes neurales in vitro-Kultursystem, um die Mechanismen der ARSA-Aufnahme und die intrazelluläre ARSA-Aktivität zu studieren, sowie mögliche Wirkstoffe, die diese Prozesse beeinflussen können, zu evaluieren.<br /> Um die Funktionalität sowie mögliche Sulfatidakkumulationen und Myelinisierungsdefekte in den MLD-abgeleiteten Oligodendrozyten in vivo zu untersuchen, wurden die Zellen in ein krankheitsspezifisches Milieu eingebracht. Hierfür wurde ein Mausmodell generiert, welches die ARSA-Defizienz mit einer Myelin-Defizienz kombiniert. Mit Hilfe histologischer Analysen konnten prominente Sulfatidablagerungen besonders in den myelindefizienten faserreichen Strukturen des Gehirns demonstriert werden. Erste Transplantationsstudien in neonatale Mäuse zeigten, dass die RGL-NPCs für mindestens 8 Wochen überlebten, sich in das Empfängergewebe integrierten und in gliale Subtypen differenzierten. Die transplantierten Zellen waren in der Lage, MBP-positive Oligodendrozyten zu bilden. Dieses Xenotransplantat-Modell kann Aufschluss über mögliche oligodendrogliale Fehlfunktionen im Zusammenhang mit der ARSA-Defizienz und den Sulfatidablagerungen geben....