In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an 9 hASA-Proteinen durchgeführt, um detaillierte Informationen über deren Prozessierung, Qualitätskontrolle und Assoziation zu Oligomeren innerhalb des endoplasmatischen ...

Zellen stehen in ständiger mechanischer Kommunikation mit ihrer Umgebung. So können sie extrazelluläre Reize wahrnehmen und verarbeiten sowie selbst Kräfte generieren und auf ihre Umwelt übertragen. Hierzu müssen Zellen ...

The cell membrane not only mechanically separates the interior of the cell from the exterior environment but is also an active organelle involved in a host of functions like maintaining osmotic balance, aiding in ...

In eukaryotischen Zellen ist fast die gesamte genetische Information in Form chromosomaler DNA im Zellkern gespeichert, während die molekulare Maschinerie zur Translation ausschließlich cytoplasmatisch lokalisiert ist. Der ...

Successful fertilization depends on the ability of sperm to locate the egg. Sperm from different species rely on diverse signaling components to gather chemical and physical cues and transduce them into a behavioral swimming response. External fertilizers like the sea urchin Arbacia punctulata release their gametes into the sea water, where the sperm have to find the egg. Here, the oocyte secretes a chemoattractant – a small peptide called resact. Resact binds to chemoreceptor on sperm flagella, causing an elevation in the intracellular cGMP concentration, which results in a sequence of events that ends with Ca²⁺ influx. [Ca²⁺]i modulates sperm flagellar movement, thereby allowing sperm to adjust their swimming direction up the concentration gradient and towards the egg in a process called chemotaxis. A. punctulata sperm are able to register the binding of a single resact molecule; however, the mechanism underlying single-molecule sensitivity and the ensuing cGMP homeostasis are not well understood. Therefore, I first established an in vivo assay to measure cGMP dynamics using reverse opto-chemical engineering (ROCE). My results provide insights into the molecular mechanism how sperm transduce a periodic change in chemoattractant concentration into a periodic change in the asymmetry of the flagellar beat. I also used ROCE to study the single-molecule response in sperm and provide a quantitative description of the molecular events underlying the single-molecule sensitivity in sperm. Moreover, the supra-molecular arrangement of the signaling cascade controlling sperm behavior in sea urchin and mammalian sperm are not known. Therefore, I developed a new labeling strategy to tag the chemoreceptor in sea urchin sperm to elucidate its supra-molecular organization. In mammals, and in particular in human sperm, the “chemoreceptor” is CatSper, the principal Ca²⁺ channel controlling sperm motility. Using super-resolution microscopy, I unraveled the quadrilateral arrangement of CatSper in mouse and in human sperm.<br /> Before sperm are mature and able to navigate their way to the egg, they have to develop from a round cell into an elongated cell with a head and a tail during spermatogenesis. The non-lysosomal glucosylceramidase GBA2 degrades glucosylceramide (GlcCer) to glucose and ceramide. Lack of GBA2 results in a condition called globozoospermia - manifested with severe morphological defects in mouse sperm. GlcCer accumulation in the absence of GBA2 and the subsequent dysregulation of cytoskeletal dynamics is thought to underlie the defects in sperm shaping during spermatogenesis. I established methods to study the effect of lipid environments on cytoskeletal dynamics to reveal the physiological function of GBA2 during sperm development. My results suggest a novel role for GlcCer as a key regulator for cytoskeletal dynamics during sperm development....
Um die Eizelle zu befruchten, müssen die Spermien die Eizelle zunächst lokalisieren. Dabei helfen ihnen unterschiedliche chemische oder physikalische Signale auf dem Weg zur Eizelle, die dann das Schwimmverhalten der Spermien steuern. Externe Befruchter, wie z.B. der Seeigel Arbacia punctulata, geben ihre Ei- und Samenzellen in das Seewasser ab, worauf die Spermien den Weg zur Eizelle finden müssen. Um die Spermien auf ihrem Weg zu leiten, sekretiert die Eizelle ein kleines Peptid (resact), welches als Lockstoff für die Spermien dient. Die Spermien schwimmen stets auf höhere Resactkonzentrationen zu. Dieses Verhalten bezeichnet man als Chemotaxis. Resact bindet an einen Rezeptor auf dem Flagellum der Spermien, was zu einer Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration führt. cGMP steht am Anfang einer Signalkaskade, die schließlich zu einem Ca²⁺-Einstrom und damit zu einer Änderung des Schwimmverhaltens führt. . Spermien von Arbacia punctulata sind in der Lage einzelne Resactmoleküle zu detektieren. Der molekulare Mechanismus, der sowohl der Einzelmolekülsensivität als auch der cGMP-Homöostase zugrunde liegt, ist nur unzureichend verstanden. Daher habe ich ein in vivo Verfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, den zeitlichen Verlauf der cGMP-Konzentration während der Resactdetektion nachzustellen. Diesem liegt das sogenannte reverse opto-chemical engineering (ROCE) zugrunde. Meine Ergebnisse liefern quantitative Einblicke in die molekularen Mechanismen, mit der Spermien periodische Änderungen der Lockstoffkonzentration in Änderungen der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration und schließlich des Schwimmverhalten umsetzen. Des Weiteren ist die supramolekulare Anordnung der Signalkomponenten, die das Schwimmverhalten von Seeigel- sowie Säugetierspermien kontrollieren, weitgehend unbekannt. Daher habe ich eine Strategie entwickelt, den Resactrezeptor in Seeigelspermien zu markieren und so die supramolekulare Organisation zu untersuchen. In Säugetierspermienist der der Ca²⁺-Kanal CatSper verantwortlich für den Ca²⁺-Einstrom und steuert so das Schwimmverhalten. Mit Hilfe der super-resolution-microscopy konnte ich zeigen, dass CatSper bei Mäusen und beim Menschen in vier Reihen entlang des Flagellums angeordnet ist.<br /> Während der Spermatogenese entwickeln sich Spermien mit Kopf und Schwanz aus runden Vorläuferzellen. Die nicht-lysosomale Glycosylceramidase GBA2 spaltet Glycosylceramid (GlcCer) zu Glukose und Ceramid. Ein erhöhte zelluläre GBA2-Konzentration führt zu Globozospermie,einem schwerwiegenden morphologischen Defekt in Mäusespermien. Wir konnten zeigen, dass diesen Defekten eine Fehlregulierung der zytoskelettalen Dynamiken zugrunde liegt, bedingt durch die Anreicherung von GlcCer in der Zelle. In meiner Arbeit habe ich neue Methoden entwickelt, die ermöglichen, den Einfluss der Lipidumgebung auf die Dynamik des Zytoskellets zu untersuchen und somit die physiologische Rolle von GBA2 in der Spermatogenese zu studieren....

Die Ribosomenbiogenese ist ein essentieller Prozess aller lebender Zellen, da ohne funktionale Ribosomen die Proteinsynthese in der Zelle zusammenbricht. Da der Prozess der Ribosomenbiogenese demnach so wichtig ist, wurde dieser bereits seit langem und detailliert untersucht. Dennoch blieb der Blick auf den Prozess ein statischer.<br /> In dieser Arbeit wurde erstmals die Biogenese auf Einzelmolekülebene in vivo durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Fluoreszenzmarkierung der in dieser Arbeit untersuchten kleinen Untereinheit in vivo gelang durch Dim2, einem Prozessierungsfaktor, der alle Vorläuferstufen der naszierenden Untereinheit begleitet. Dim2 wurde homolog als autofluoreszentes Fusionsprotein exprimiert, einmal mit eGFP, zum anderen mit einem Snap-Protein. Das Snap-Protein ist ein Derivat der O-6-Alkylguaninalkyltransferase und muss mit einem organischen Farbstoff gekoppelt werden. In dieser Arbeit wurde mit SiR-Snap gefärbt.<br /> Zur Expression beider Fusionsproteine wurden sowohl transiente als auch stabile Transfektionen durchgeführt. Die stabil überexprimierende Zelllinie zeigte einen hohen Anteil an ungebundenem Dim2, sodass für die weiteren Mobilitätsuntersuchungen eine mit Tetracylin induzierbare Zelllinie verwendet wurde.<br /> Durch FRAP- und Einzelmolekülexperimente konnte die intranukleäre Mobilität des Dim2 und der kleinen Untereinheit erfolgreich bestimmt werden. Die gefundenen Trajektorien wurden auf zwei verschiedene Arten analysiert. In beiden Analysen wurden drei Mobilitätskomponenten gefunden. Eine frei diffundierende Komponente mit einem Diffusionskoeffizienten von etwa D_f = 2,5 μm²/s, eine verlangsamte von etwa D_r = 0,3 μm²/s sowie eine immobile Komponente von etwa D_i = 0,05 μm²/s. In den beiden Kerndomänen Nukleolus und Nukleoplasma sind die drei Mobilitätskomponenten jedoch unterschiedlich stark vertreten. Während im Nukleolus die immobile Fraktion mit etwa 60 % den größten Anteil stellt und die mobile Fraktion mit etwa 7 % kaum vorhanden ist, sind im Nukleoplasma nur etwa 35 % der beobachteten Untereinheiten immobil.<br /> Außer der intranukleären Mobilität wurde zusätzlich der Exportprozess der Vorläuferuntereinheit aus dem Kern heraus verfolgt. Hierfür wurden zwei unterschiedliche Ansätze gewählt, um die Bewegung durch die Kernhülle visualisieren zu können. Einmal wurden Messungen auf Höhe des Zellkernäquators durchgeführt, die anderen Messungen auf dem Boden des Zellkerns. Damit waren Untereinheiten, die exportiert werden, einmal in horizontaler und einmal in vertikaler Bewegung zu beobachten. Es konnten allerdings nur einzelne Teilschritte des Exportprozesses abgebildet werden. Die ununterbrochene Beobachtung eines vollständigen Exportereignisses mit den Teilschritten Andocken - Transport - Loslösen gelang nicht....

Exponential advancements in computer technology over the last five decades have ubiquitously benefited science and humanity as a whole. Consequent beneficiaries of this surge of computational power include all subfields of science that fall under the umbrella of “biochemical research”. Specifically, proteins, possibly the most versatile of all biological macromolecules, have always been the subject of extensive experimental investigation and more so from a pharmaceutical perspective, since the majority of pharmaceutical drugs target proteins. In silico methods assist experimental research on proteins in multiple ways ranging from relatively simple tasks such as organizing sequences and structures in biological databases to providing atomistic level insights into the structure and dynamics, that form the basis of the biological function of the protein. Given the unquestionable certitude that the three-dimensional structure of the protein determines its function, understanding the formation of structure from sequence, i.e. protein folding, is a central theme of investigation. Despite massive improvements in the understanding of protein folding over the last 50 years, it still remains an unsolved problem. <br /> Herein, computational approaches involving a combination of molecular modeling and biomolecular simulations are pursued to study important biochemical phenomena, namely, protein folding and protein-ligand interactions. In terms of protein folding, a specific problem, i.e. oxidative self-folding is investigated. Oxidative folding refers to folding that involves the covalent linkage of cysteine residues in proteins to form disulfide bonds that stabilize the folded structure. Disulfide bonds play multifaceted roles in the peptides and proteins that they occur in, from providing structural integrity to acting as allosteric switches that regulate function. Current knowledge on oxidative folding has been restricted to consensuses derived from observing the folding of various model peptides and proteins. Most notably, the oxidative folding pathways of the proteins bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and hirudin have been used as extreme models based on the manner in which the disulfide bond formations occur. However, the folding of a large group of such disulfide-rich peptides and proteins has been vaguely described to fall in between these extreme models. In this study, conotoxins, a class of venom peptides derived from marine cone snails of the genus Conus are used as candidates to study their oxidative folding, and to determine their place between the aforementioned extremes defined by BPTI and hirudin. With their ability to potently and selectively block voltage-gated sodium channels, conotoxins invoke broader a pharmaceutical interest than being mere model peptides to study oxidative folding. Furthermore, disulfide isomers of tridegin, a 66mer peptide produced by the giant Amazon leech Haementeria ghilianii are investigated for the role of disulfide bonds concerning folding, stability and function. The pharmaceutical significance of tridegin is that, it is the only known peptide inhibitor of the blood coagulation factor XIIIA, and shows great promise as a lead substance in anti-coagulation therapy. <br /> Heme being an effector molecule, conveys a regulatory effect on the proteins it binds to, affecting their physiological functions. Protein-ligand interactions in the form of the transient binding of heme to proteins is investigated herein using molecular docking and molecular dynamic simulations. Finally, a decade’s worth of experimental knowledge obtained on transient heme-protein interactions is presented as an algorithmic implementation to predict transient heme-binding motifs in protein sequences, enabling the identification of novel heme-regulated proteins. Overall, this work serves as a testament to the growing significance of in silico methods in aiding experimental biochemical research....