In dieser Arbeit sollte anhand der Mutationen von menschlichem Cx31 und Maus Cx45, zum einen die funktionelle Bedeutung der Mutationen, die auf unterschiedlichen Domänen lokalisiert sind, und ihr dominanter Effekt auf die Funktion der Wildtyp-Proteine untersucht werden, und zum anderen der mögliche Zusammenhang zwischen den Mutationen und den Cx-bedingten Krankheiten hergestellt werden. <br /> Verschiedene Mutationen des Cx31-Gens wurden in der Haut von Patienten mit der Hautkrankheit Erythrokeratodermia variabilis identifiziert. Um den Zusammenhang zwischen den Mutationen und den Symptomen herzustellen, wurden Mutanten, bei denen Aminosäuren verändert waren, die bei allen Connexinen der ß-Klasse konserviert sind, in die HeLa-Zellen transfiziert und charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass die Expression der mutierten hCx31 G12R-Proteine eine Letalität der HeLa-Zellen zufolge hatte (Diestel et al., 2002). Deshalb wurden die mutierte Cx31 G12R- und C86S-cDNS in die HeLa-Zellen mit Cx31-WT transfiziert und die Doppeltransfektanten charakterisiert. In Immunofluoreszenz-Analysen wurde festgestellt, dass sowohl Cx31-WT-, als auch mutierte Cx31-Proteine an den Kontaktmembranen lokalisiert sind. Bei den Doppeltransfektanten mit Cx31-WT und G12R, bzw. C86S wurde nicht nur erhöhte Durchlässigkeit der Farbstoffe Lucifer Yellow und Neurobiotin, sondern auch ein Transfer der Farbstoffe Ethidiumbromid und Propidiumjodid festgestellt, im Gegensatz zu der HeLa hCx31WT Einfachtransfektante. Dieser dominant positive Effekt auf die Durchlässigkeit der Kanäle wurde besonders bei dem Verhältnis 1:0,15-0,3 von Cx31-WT und Mutanten deutlich. Bei den Doppeltransfektanten von HeLa rCx43/G12R wurde festgestellt, dass die Cx43-WT-Proteine teilweise die erhöhte Kopplung der mutierten Cx31-Proteine reduzieren können, wie hinsichtlich des immer noch erhöhten Farbstofftransfers festgestellt wurde. Daraus kann man schließen, dass die Mutationen G12R am N-Terminus und C86S in der 2. Transmembrandomäne des Cx31-Proteins eine Konformationsänderung und damit erhöhte Kopplung verursachen, wobei dieser Effekt durch Cx43-WT kompensiert werden konnte und sogar G12R und C86S einen transdominanten Effekt auf die Funktion der Cx43-Proteine ausüben (gain of function). <br /> C122 ist eine Mutante von Maus Cx45, bei der 26 Aminosäuren mit 9 Seinresten am CTerminus deletiert sind. Der größte Teil der C122-Proteine in HeLa C122-Transfektanten ist im perinukleären Raum lokalisiert und zeigt keine Kopplung mit dem Farbstoff Lucifer Yellow. Um die funktionelle Rolle von C122 und seinen möglichen dominanten Effekt zu untersuchen, wurde die deletierte Cx45, C122-cDNS in die HeLa-Zellen mit Cx45-WT transfiziert und die Doppeltransfektanten charakterisiert. Bei den Doppeltransfektanten mit Cx45-WT und C122 wurde eine reduzierte Durchlässigkeit des Farbstoffs Lucifer Yellow und Neurobiotin festgestellt, im Vergleich zur HeLa mCx45 Einfachtransfektante. Dieser dominant negative Effekt auf die Durchlässigkeit der Kanäle korreliert direkt mit der C122- Expression. Die Immunofluoreszenz-Analyse zeigte, dass der Membrantransport von Connexin-Proteinen auch direkt abhängig von den C122-Mengen in Doppeltransfektanten ist, wobei die Halbwertszeit und die Oligomerisierung von Cx45 und C122 kaum Unterschiede zeigten. Daraus kann man schießen, dass der C-Terminus von Cx45 für den Transport und die Funktion wichtig ist und einen dominant positiven Effekt auf den Transport von C122 ausüben kann und damit der funktionelle Defekt der C122-Proteine durch HeLa Cx45-WTProteine aufgehoben werden kann....

Das Gap Junction-Protein Connexin45 (Cx45) kann interzelluläre Kanäle ausbilden und wird unter anderem in Gehirn, Herz und Interneuronen der Retina der adulten Maus exprimiert. Sein Fehlen führt zu einer embryonalen ...

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine transgene Mauslinie, welche das mutierte Connexin43 (Cx43D378) konditional exprimieren kann, erzeugt. Mittels des Zielvektors „Cx43D378stopKI“ konnte der Austausch der Cx43 kodierenden ...

Connexin57 (Gja10) unterscheidet sich in mehrerer Hinsicht von anderen Connexin-Genen. Seine Expression ist in der adulten Maus auf Horizontalzellen der Retina sowie einige wenige Zellen eines unbekannten Zelltyps im Thymus ...

Für Untersuchungen der genauen Lokalisation des Cx45 Proteins in Geweben wurde ein Austauschvektor erstellt, bestehend aus zur Verfügung stehenden Sequenzabschnitten des Cx45 und dem „enhanced cyano fluorescent protein ...

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der carboxyterminal verkürzten Cx43 Protein Isoform Cx43K258stop sowohl in HeLa-Zellen als auch in der transgenen Mauslinie Cx43K258stop erreicht. <br /> Mit Hilfe der ...

In der vorliegenden Arbeit wurde eine transgene Maus als Modell für die humane Erbkrankheit der Haut Erythrokeratodermia variabilis (EKV) erzeugt. EKV wird im Menschen unter anderem durch eine Punktmutation im Cx31-Gen verursacht, so dass an der Aminosäure-Position 137 F (Phenylalanin) durch L (Leucin) ersetzt wird. <br /> Die Charakteristika der EKV Maus mit dem Genotyp Cx31+/F137L wurden mittels Immunfloureszenz, Immuno-Blot, Southern Blot und Wundheilungsanalysen untersucht. Weiterhin wurde die Cx31F137L Mutation in Zellkultur genauer analysiert. <br /> In HeLa Zellen führt die Expression der Cx31F137L Form zum Absterben der Zellen. In embryonalen HM1 Stammzellen wurde bei heterozygoter Expression der Mutation Cx31F137L eine Reduktion der Neurobiotinkopplung um etwa ein Drittel beobachtet. Diese starke Reduktion der Kopplung deutet auf einen transdominant negativen Effekt auf Cx43 oder Cx45 hin. Eine erhöhte Halbkanalaktivität wurde in ES Zellen, welche die Cx31F137L Mutation ausprägen, nicht nachgewiesen. <br /> Cx31+/F137L Mäuse sind lebensfähig und fertil. Sie zeigen makroskopisch keinen auffälligen Phänotyp und werden normal alt. Die Expression der Cx31F137L in der Epidermis der Mäuse führt bei der Untersuchung von Schwanzschnittwunden zu einer um etwa einen Tag beschleunigten Wundheilung, ebenso wie von Kretz et al., 2004 für Mäuse beschrieben, bei denen Cx43 in der Haut ausgeschaltet wurde. Dies ist ein weiteres Indiz für den Effekt der Cx31F137L Mutation auf Cx43. <br /> In ca. 5% der untersuchten Schwanzhaut der Cx31+/F137L Tiere wurden deutliche Verdickungen der Epidermis und vor allem der Stachelzellschicht (Akanthose) beobachtet. Dieser seltene Effekt ähnelt dem in menschlichen Patienten viel häufiger beobachteten Phänotyp, so dass diese Mausmutante in dieser Hinsicht als Modell für die humane Erkrankung EKV dienen kann. <br /> Patienten mit homozygoter Cx31F137L Mutation wurden bisher nicht beschrieben. Cx31F137L/F137L starben als Embryonen an Tag 8 dpc. Die Expression des Cx31 in der Plazenta kann nicht der Grund dafür sein, da die Ernährung des Embryos zu diesem Zeitpunkt noch über Diffusion erfolgt. Die genaue Todesursache ist daher noch unklar. <br /> Cx31-/F137L Mäuse zeigen keine offensichtlichen phänotypischen Anomalien sondern werden mit erwarteter Häufigkeit geboren. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Cx31F137L Mutation phänotypische Änderungen bei Mäusen und Menschen durch (trans)dominante Wirkungen (auf andere Connexinisoformen) auslöst....

For astrocyte restricted connexin mutations/deletions the Cre/loxP system of site-specific recombination method was applied in this study. However, the Cre recombinase mediated gene deletion/activation is not free of ...

Communication through Gap Junctions could be regulated by multiple mechanisms. In this work the role of degradation of connexins as a mean to modulate communication was investigated. Furthermore the influence of phosphorylation ...