Lipid-basierte Transfektionssysteme für die posttranskriptionelle Expressionshemmung von endothelialem VCAM-1 als potentiell antiinflammatorischer Therapieansatz

Abstract

Bei der Entstehung von Entzündungen ist das vaskuläre Endothel von zentraler Bedeutung: Stimuliert durch Entzündungsmediatoren exprimieren Endothelzellen eine Reihe proinflammatorischer Adhäsionsrezeptoren, die eine Anhaftung zirkulierender Leukozyten vermitteln und so deren Einwanderung in das geschädigte Gewebe ermöglichen. Daher wird postuliert, dass die Ausschaltung endothelialer Adhäsionsrezeptoren wie vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) eine antiinflammatorische Wirkung zeigt und insofern eine interessante Option zur Therapie chronisch-entzündlicher Erkrankungen darstellt.<br /> Die (partielle) Ausschaltung von VCAM-1 in murinen bEnd.3-Endothelzellen erfolgte durch posttranskriptionelle Expressionshemmung unter Verwendung von siRNA oder shRNA-kodierenden Plasmiden. Stellvertretend für Leukozyten wurde an Tumorzellen demonstriert, dass durch einen endothelialen VCAM-1-Knockdown eine reduzierte Adhäsion zirkulierender Zellen an immobilisierte Endothelzellen in vitro erreicht werden kann. Dieses Ergebnis bestätigt das Potential der oben vorgestellten Strategie und bildete die Grundlage für die nachfolgende Entwicklung eines lipidbasierten Gentransfersystems, mit dessen Hilfe Nukleinsäuren zur Ausschaltung von VCAM-1 in Endothelzellen eingebracht werden können.<br /> Mit Hinblick auf eine perspektivische Anwendung in vivo wurden sterisch-stabilisierte Liposomen untersucht, die bekanntermaßen eine gute Pharmakokinetik und Verträglichkeit aufweisen. Unter Einsatz der Dualen Asymmmetrischen Zentrifugation konnte sowohl siRNA als auch Plasmid-DNA sehr effizient in Liposomen eingeschlossen werden. In Versuchen zur Integrität und Funktionalität sowie zur zellulären Aufnahme lieferten die liposomalen Nukleinsäuren positive Resultate. Durch Verwendung von Liposomen mit pH-sensitiven Eigenschaften konnte die intrazelluläre Wirkstofffreisetzung entscheidend verbessert werden. Dennoch wurde weder durch Transfektion von liposomaler siRNA noch durch liposomale shRNA eine RNAi-spezifische Expressionshemmung von endothelialem VCAM-1 in vitro erreicht. <br /> Als weiteres lipidbasiertes Gentransfersystem wurden stabilized plasmid-lipid particles (SPLP) geprüft. Anhand eines GFP-kodierenden Reporterplasmids wurde gezeigt, dass diese im Gegensatz zu Liposomen eine Transfektion von bEnd.3-Zellen vermitteln können. Zur Steigerung der Transfektionseffizienz von SPLP wurden zwei Ansätze verfolgt: Durch Modifikation der Lipidzusammensetzung sollte pH-abhängig die intrazelluläre Freisetzung der Nukleinsäuren gefördert werden. Jedoch wurde festgestellt, dass die Bildung von SPLP auf einem sensiblen Gleichgewicht kationischer Lipidbestandteile und anionischer DNA beruht, die mit der Einführung einer anionischen pH-sensitiven Lipidhülle trotz diverser Bemühungen nicht vereinbar war. Zum anderen sollten Immuno-SPLP für eine verbesserte zelluläre Aufnahme sowie einen zielgerichteten endothelialen Gentransfer hergestellt. Die Funktionalisierung von SPLP mit einem anti-Endoglin-Antikörperfragment gelang mithilfe der Postinsertionsmethode. Endoglin-gerichtete Immuno-SPLP zeigten eine spezifische Bindung und gesteigerte Internalisierung an bEnd.3-Zellen. Eine signifikante Verbesserung des in vitro-Transfektionspotentials von SPLP wurde dadurch dennoch nicht erzielt. Die Transfektion von bEnd.3-Zellen mit VCAM-shRNA zur Ausschaltung von VCAM-1 wurde daher mithilfe unfunktionalisierter SPLP durchgeführt. Dies resultierte in einer signifikanten Expressionshemmung von VCAM-1, die auf einem spezifischen shRNA-Plasmid-vermittelten Effekt sowie auf einem unspezifischen Effekt des lipidbasierten Carriersystems beruhte. Die Ursache dieser Beobachtung blieb ungeklärt, ein toxischer Effekt des Transfektionssystems konnte jedoch ausgeschlossen werden.