Entwicklung und Validierung molekularbiologischer Methoden zur Identifizierung von Arzneipflanzen in Ausgangsdrogen, Drogenzubereitungen und in Fertigarzneimitteln

Abstract

Pflanzliche Arzneimittel von konsistenter Qualität bedingen klar definierte und zuverlässig geprüfte Ausgangsmaterialien. Mit den bislang in der Ph. Eur. etablierten Methoden zum Nachweis der Identität pflanzlicher Stoffe (und deren Zubereitungen) werden allerdings nicht immer eindeutige Ergebnisse erzielt. Einen zusätzlichen Informationsgewinn verspricht hier der Einsatz von PCR-basierten Markermethoden. Derartige Methoden werden bereits seit Jahren erfolgreich in weiten Bereichen der molekularen Phylogenie, Forensik oder Pflanzenzucht eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wird daher die Eignung möglichst einfacher und universeller PCR-Strategien als neue komplementäre Analysetechniken für die Identitätsprüfung pflanzlicher Stoffe in der pharmazeutischen Qualitätskontrolle untersucht.<br /> Es wird ein Verfahren aufgezeigt mit dem, sowohl aus pflanzlichen Ausgangsmaterialien wie auch aus deren Verarbeitungen (z. B. Extrakten und Fertigarzneimitteln), verlässlich amplifizierbare DNA erhalten werden kann. Als DNA-analytische Untersuchungsmethoden werden exemplarisch die vergleichende Sequenzierung des nrITS-Bereiches sowie die RAPD-Technik evaluiert.<br /> Es wird dargelegt, dass sich unspezifische fragent-basierte PCR-Methoden wie die RAPD-Technik nicht zur Überprüfung von prozessierten pflanzlichen Materialien eignen. Eine grundsätzliche Eignung besteht diesbzgl. jedoch für sequenz-basierte Methodenansätze.<br /> Zur Amplifizierung des nrITS-Bereiches werden neue pflanzenspezifische Universalprimer abgeleitet. Mit ihnen wird eine deutlich höhere Erfolgsrate bei Amplifikation und Direktsequenzierung erreicht, als mit den Standardprimern nach White et. al.<br /> Die PCR-Methode, mit den neu abgeleiteten nrITS-Primern, wird am Beispiel von Matricariae flos bezüglich der Parameter Spezifität, Robustheit, Sensitivität und Präzision charakterisiert. Es zeigt sich, dass die Zuverlässigkeit der ITS-Methode allerdings aufgrund intraspezifischer Variationen mit zunehmender Degradierung der DNA abnimmt. In Versuchen gelingt es das eingesetzte Pflanzenmaterial auf der Stufe der pflanzlichen Zubereitungen noch in 30% der Fälle sowie auf der Stufe von Fertigarzneimitteln in 20% der Fälle, zu identifizieren. Zur Steigerung der Ergebnissicherheit wird deshalb eine Kombination mit weiteren Marker-Daten befürwortet.<br /> Als weiterer Teil dieser Arbeit wird mit dem Aufbau einer validen Sequenzsammlung begonnen. Die ermittelten Daten von 50 verschiedenen pflanzlichen Stoffen aus dem Europäischen Kulturkreis sowie 10 TCM Belegmaterialien werden in GenBank hinterlegt.