Novel Small Molecule Inhibitors Dissecting GEF-dependent and -independent Cytohesin Functions in Immune Cell Signaling

Abstract

Cytohesins are guanine nucleotide exchange factors (GEFs) for the small GTPases of the ARF family. They play important roles in immune cell signaling, immune cell adhesion and migration and furthermore in non-immune insulin signaling and regulation of Erb activation. Cytohesin-1 was first discovered as an interactor with the alpha_L/beta₂ integrin LFA-1 and later as important regulator of T cell signaling in the course of T cell activation.<br /> Investigation of cytohesin function relied on overexpression and downregulation of the protein in a cellular context until recently the small molecule inhibitor Secin H3 was discovered. However, in immune cells Secin H3 was only insufficiently capable of inhibiting cytohesin-mediated processes. In a multidisciplinary approach, bioinformatic<em> in silico</em> predictions for novel molecules derived from the structurally similar Secin H3 were examined for their ability to serve as inhibitors for cytohesin functions in various screening assays. These assays were selected, because they involved different cytohesin functions and cytohesin family members, respectively.<br /> In the outcome of these functional screening assays, two novel small molecules, namely Secin 16 and Secin 144, showed interesting inhibition profiles. With the use of Secin 16, it was possible to inhibit GTP-exchange of ARNO towards ARF1, steppke-dependent insulin signaling and T cell adhesion to ICAM-1 with significantly more potency compared to Secin H3. In contrast, Secin 144 employment abrogated cytohesin-1 mediated T cell adhesion to ICAM-1, whereas GTP-exchange activity or <em>drosophila</em> insulin signaling was left unaffected. Further characterization of these two small molecule inhibitors revealed that they are able to inhibit reported functions of all cytohesin family members without toxic side effects and that they specifically interact with the Sec7 domain of cytohesin-1<em> in vitro</em>. However, Secin 144 was a specific inhibitor for cytohesin-mediated integrin activation and did not interfere with cytohesin functions related to its GEF-activity. In contrast, Secin 16 was able to inhibit both, adhesion- and GEF-related processes that are linked to cytohesin activity.<br /> The combination of these two novel inhibitors was then further exploited for the investigation of cytohesin-mediated processes and their dependency on catalytic cytohesin GEF-activity. It is shown here, that cytohesin-mediated leukocyte adhesion on endothelial cells is mainly achieved by the interaction between cytohesin-1 and LFA-1 and independent of the catalytic GEF-activity of cytohesin proteins. Furthermore, cytohesin-mediated signaling in T cell activation is mainly dependent on the ability of cytohesin GTP-exchange. Hence, cytokine production, T cell proliferation and ERK1/2 phosphorylation are abrogated, when the pan-cytohesin inhibitor Secin 16 was used. In contrast, the employment of Secin 144 had no significant impact on the inhibition of cytohesin-mediated T cell activation.<br /> Furthermore, immune cell migration is dependent on both, cytohesin GTP-exchange activity and cytohesin-mediated activation of LFA-1. Immune cells are able to switch between integrin-dependent and –independent modes of migration. In integrin-dependent migration the GEF-activity as well as the LFA-1 activation mediated by cytohesin proteins is indispensable for proper forward locomotion in various immune cells. However, in three-dimensional environment integrins are not required for immune cell migration. In this context, only inhibition of the catalytic GEF-activity of cytohesin proteins is impairing migration. In contrast, inhibition of cytohesin-mediated LFA-1 activation does not impair three-dimensional chemotaxis.<br /> In conclusion, the novel small molecule inhibitors for cytohesin function are potent tools for the dissection of GEF-dependent and -independent cytohesin functions.

Cytohesine sind Guaninnukleotid-Austausch Faktoren für die kleinen GTPasen der ARF-Protein-Familie. Sie spielen sowohl in der Signaltransduktion, der Adhäsion und der Migration von Immunzellen als auch in der Insulinsignalkaskade und der ErbB Regulation in Nicht-Immunzellen eine entscheidende Rolle. Cytohesin-1 wurde zunächst als Interaktionspartner des alpha_L/beta₂-Integrins LFA 1 entdeckt und später als wichtiger Regulator der T Zell-Aktivierungskaskade und Aktivator von RhoA in der Migration dendritischer Zellen identifiziert.<br /> Die Untersuchung der Cytohesin Funktion in Immunzellen basierte vornehmlich auf Überexpressionsstudien und Herunterregulierung des Proteins auf mRNA-Ebene mit Hilfe von RNAi bis der organische Molekülinhibitor Secin H3 entdeckt wurde, mit dessen Hilfe eine effektive Inhibition der Cytohesin-Aktivität erreicht werden konnte. Im immunologischen Kontext allerdings zeigte der Inhibitor eine unzureichende Effizienz in der Inhibition von Cytohesin-vermittelten Funktionen. In einem interdisziplinären Ansatz aus Bioinformatik, Chemie und Biologie wurden deshalb neue Moleküle identifiziert, die als Cytohesin Inhibitoren mit verbesserter Wirkeffizienz fungieren sollten. Ausgehend von Secin H3 als Leitstruktur wurden zu diesem Zweck <em>in silico</em> Vorhersagen für kleine organische Moleküle getroffen, die im Folgenden auf ihre Fähigkeit zur Inhibition von Cytohesin Proteinen funktionell untersucht wurden. Hierzu wurden Screening-Assays benutzt, in denen sowohl unterschiedliche Cytohesine als auch unterschiedliche Cytohesin Funktionen betroffen waren.<br /> Mit Hilfe der funktionellen Screening-Assays wurden zwei neuartige Moleküle, Secin 16 und Secin 144 identifiziert, die interessante Inhibitionsprofile zeigten. Der Einsatz von Secin 16 in diesen Assays ermöglichte die Inhibition sowohl des GTP-Austauschs an ARF1 von Cytohesin-2, als auch steppke-vermittelte Insulin-Signaltransduktion in der Fruchtfliege und T-Zell-Adhäsion an ICAM-1 durch Cytohesin-1. Verglichen mit Secin H3 konnte eine signifikant stärkere Inhibition in allen Assays beobachtet werden. Im Gegensatz dazu konnte durch die Verwendung von Secin 144 ausschließlich die T-Zell Adhäsion auf ICAM-1-Untergrund inhibiert werden, während sowohl die GTP-Austausch-Aktivität von Cytohesin-2 an ARF1 als auch die Insulin-Signaltransduktion in D. melanogaster unverändert blieben. Durch die weitere Charakterisierung dieser kleinen organischen Moleküle konnte gezeigt werden, dass diese Inhibitoren spezifisch an die Sec7 Domäne von Cytohesin-1 binden. Des Weiteren zeigten Secin 16 und Secin 144 in kultivierten Zellen keine toxischen Nebeneffekte. Allerdings konnte mit Hilfe von Secin 144 ausschließlich die Cytohesin-vermittelte Integrinaktivierung unterbunden werden, nicht aber Cytohesin-Funktionen, die durch die GEF-Aktivität der Proteine bedingt waren. Im Gegensatz dazu war es möglich durch den Gebrauch von Secin 16 beide bekannten Cytohesin-1 Funktionen, nämlich LFA-1 Aktivierung und GTP-Austausch an ARF-GTPasen mit großer Effizienz zu inhibieren.<br /> Im Folgenden wurden deshalb beide neuen Inhibitoren in Kombination eingesetzt, um Cytohesin-regulierte Prozesse auf ihre GEF-Abhängigkeit zu untersuchen. Es konnte hier gezeigt werden, dass Cytohesin-vermittelte Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen hauptsächlich, wenn nicht ausschließlich auf der Interaktion zwischen Cytohesin-1 und LFA-1 beruht und unabhängig von der katalytischen GEF-Aktivität von Cytohesin-Proteinen ist. Weiterhin ist die T-Zell Aktivierung in weiten Teilen abhängig von der GEF-Funktion der Cytohesine, weshalb Zytokin-Produktion, T-Zell Proliferation und ERK1/2 Phosphorylierung stark reduziert waren, wenn Secin 16 als Cytohesin-Inhibitor eingesetzt wurde, nicht aber wenn Secin 144 benutzt wurde. <br /> Immunzell-Migration ist hingegen sowohl abhängig von der vollständigen Aktivierung von Integrinen durch Cytohesine als auch von der katalytischen GEF-Aktivität derselben. Immunzellen können zwischen Integrin-abhängiger und –unabhängiger Chemotaxis wechseln, abhängig von der Umgebung. Während der Integrin-abhängigen Migration sind sowohl die Cytohesin-vermittelte Integrinativierung als auch die GEF-Aktivität vonnöten, um gerichtete Vorwärtsbewegungen verschiedener Immunzellen zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu werden Integrine in dreidimensionalen Umgebungen nicht für die Immunzellmigration benötigt. In diesem Zusammenhang kann eine Verminderung der Chemotaxis ausschließlich beobachtet werden, wenn die katalytische GEF-Aktivität der Cytohesine durch Secin 16 inhibiert ist. Der Gebrauch von Secin 144 führte zu keiner negativen Beeinflussung der Migrationsfähigkeit in einer dreidimensionalen Collagenmatrix.<br /> Zusammenfassend stellen die neuartigen, kleinen organischen Moleküle zur Inhibition von Cytohesin Funktionen ein wertvolles Werkzeug dar, mit dem sich GEF-abhängige und unabhängige Cytohesin Funktionen unterscheiden und weiter untersuchen lassen.