Analyse der Funktion von Dynamin2 in der Integrin-vermittelten Adhäsion humaner T-Lymphozyten

Abstract

Das Immunsystem ist ein dezentralisiertes Organ, dessen zelluläre Bestandteile dazu in der Lage sein müssen, ihre Aufenthaltsorte innerhalb des Körpers rasch zu verändern, um effektive Immunantworten zu gewährleisten. So sind Immunzellen auf die Durchschreitung verschiedenster Gewebetypen spezialisiert, welche sich nicht nur in ihrer Komposition und Architektur deutlich voneinander unterscheiden, sondern auch gänzlich unterschiedliche physikalische Eigenschaften mit sich bringen können. Beispielsweise müssen Leukozyten zum einen unter dem Einfluss starker Scherkräfte an einer 2-dimensionalen endothelialen Oberfläche aus Blutgefäßen austreten, bewegen sich zum anderen aber auch durch das Interstitium, komplett eingebettet in Bestandteile der extrazellulären Matrix. Während manche Situationen wie die Extravasation aus Blutgefäßen eine starke Adhäsion der Leukozyten erfordern, können andere Prozesse, wie die Bewegung durch räumlich beengende 3-dimensionale Umgebungen, auch ohne eine Adhäsion der Zellen stattfinden. Dementsprechend sind die meisten Immunzellen dazu in der Lage, ihre Adhäsionsfähigkeit schnell und präzise zu modulieren, was durch die Regulation der Aktivität ihrer wichtigsten Adhäsionsmoleküle gewährleistet wird, der Integrine.<br /> Durch die Anwendung einer ganzen Reihe unterschiedlicher molekularbiologischer, zellbiologischer, biochemischer und funktionaler Methoden konnte in der hier vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die große GTPase Dynamin2, welche bisher primär im Kontext der Endozytose und anderen Prozessen der Membrandynamik untersucht wurde, ein essentieller Regulator der Integrin-vermittelten Adhäsion und Migration humaner Lymphozyten ist. Als Modellsystem wurden vorzugsweise humane primäre CD4+ T-Zellen, teilweise aber auch Jurkat E6.1 T-Lymphozyten verwendet. Die Funktion von Dynamin2 wurde gestört, indem entweder die GTPase-Aktivität des Enzyms durch die Zugabe unterschiedlicher chemischer Inhibitoren blockiert oder die Expression der großen GTPase mit Hilfe siRNA-vermittelter RNA-Interferenz herunterreguliert wurde. Dies führte jeweils zu einer starken Reduzierung der Integrin-vermittelten Adhäsion und Migration der T-Lymphozyten in vitro. Interessanterweise konnte dieser Phänotyp jedoch nicht beobachtet werden, wenn mit Dynamin2-unabhängigen Inhibitoren der Endozytose, des vesikulären Transports oder der F-Aktin-Polymerisierung gearbeitet wurde, was den Einfluss der großen GTPase auf die Integrin-vermittelte Adhäsion von Lymphozyten von diesen Prozessen abgrenzt.<br /> Während grundlegende Signaltransduktionsprozesse in Lymphozyten ohne funktionellem Dynamin2 weiterhin ungestört ablaufen konnten, wurde in diesen Zellen jedoch ein spezifischer Effekt auf die kleine GTPase Rap1 beobachtet, einem bekannten Regulator von Integrinen, welcher nicht mehr effektiv aktiviert werden konnte. Zudem stellte die Überexpression aktivierter Rap1a-eGFP-Fusionsproteine die Integrin-vermittelte Adhäsion humaner CD4+ T-Zellen, welche mit einem Dynamin2-Inhibitor versetzt worden waren, wieder her, was eindeutig zeigt, dass Dynamin2 die Adhäsion dieser Zellen durch die Aktivierung von Rap1 reguliert. Dynamin2 konnte außerdem in Signaltransduktionskomplexen an der basalen Plasmamembran adhärenter T-Zellen beobachtet werden, in denen ebenfalls die aktivierten Tyrosinkinasen FAK, Pyk2, Kinasen der Src-Familie sowie RapGEF1 zu finden waren. Die Aktivierung von FAK und Pyk2, welche eine Grundvoraussetzung für die Bildung dieser Signalkomplexe darstellt, war abhängig von funktionellem Dynamin2, ebenso wie die Aktivierung von RapGEF1, einem wichtigen Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rap1, welcher durch Kinasen der Src-Familie aktiviert wird. Dies lässt die Vermutung zu, dass Dynamin2 durch die Organisation von Signalkomplexen die Aktivierung von Rap1 in einer FAK/Pyk2- und RapGEF1-abhängigen Weise reguliert und somit die Integrin-vermittelte Adhäsion humaner T-Lymphozyten stark beeinflusst.<br /> Integrine können auf unterschiedliche Weise in ihrer Aktivität moduliert werden. Zum einen durch die Regulation der Affinität für ihre Liganden, was durch Konformationsänderungen der einzelnen Integrin-Moleküle erreicht wird, zum anderen aber auch durch die Valenz der Integrine, also ihrem Clustering. Die kleine GTPase Rap1 wurde bereits in beiden Mechanismen der Integrin-Aktivierung impliziert. Überraschenderweise konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch kein Einfluss von Dynamin2 auf die Ausbildung von Integrin-Epitopen mit hoher Affinität für ihre Liganden beobachtet werden, während die Inhibition der GTPase-Aktivität von Dynamin2 zu einem massiven Verlust von Integrin-Clustern vor und nach der Aktivierung von T-Zellen führte. Dies spricht für eine spezifische Rolle von Dynamin2 in der Valenzregulation von Integrinen.<br /> Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte Dynamin2 somit als neuer Regulator der Integrin-vermittelten Adhäsion und Migration humaner T-Lymphozyten beschrieben werden, wobei sich die große GTPase auf diesen Prozess über die Organisation der RapGEF1-abhängigen Aktivierung der kleinen GTPase Rap1 auswirkt. Interessanterweise nimmt Dynamin2 dabei spezifischen Einfluss auf die Integrin-Valenz, wirkt sich jedoch nicht auf die Affinität von Integrinen für ihre Liganden aus. Dies lässt Dynamin2 eine Schlüsselposition bei der Differenzierung von Regulationsmechanismen der Integrin-Affinität und -Valenz zukommen, welche meist schwer voneinander zu trennen sind.