Low Endotoxin Recovery

Abstract

Eine zuverlässige Überwachung bakterieller Kontaminationen ist entscheidend für die Herstellung und Sicherheit biopharmazeutischer Produkte. Die mikrobielle Sicherheit wird in der Regel (zusätzlich zu Sterilitätstests und Umweltüberwachung) durch Tests auf das Vorhandensein von Endotoxin, mit Limulus-basierten Testmethoden (BET) gewährleistet. Endotoxin dient hierbei als Indikator für potenzielle Gram-negative bakterielle Kontaminationen. Trotz einer breiten Akzeptanz des BET als Sicherheits- und Freigabetest wird dessen Anwendbarkeit seit der Entdeckung des Low-Endotoxin-Recovery (LER) Effektes intensiv diskutiert. Dieses Phänomen beschreibt die Unfähigkeit von Limulus-basierten (LAL) Methoden, Lipopolysaccharide (LPS) aufgrund eines Matrix-assoziierten Maskierungseffekts angemessen zu erkennen. Während die zugrunde liegenden Mechanismen und die Kinetik von LER-Phänomenen in bekannten Maskierungsformulierungen und in Bezug auf ihre Auswirkungen auf LAL-Systeme gut beschrieben sind, bleibt die biologische Aktivität und Pyrogenität des maskierten Endotoxins oft unbeachtet. Darüber hinaus warf die Endotoxinheterogenität die Frage auf, wie und bis zu welchem Umfang LER einerseits durch die Quelle von LPS und andererseits durch seine Wechselwirkung mit komplexen Matrizen, wie z. B. tatsächlichen pharmazeutischen Produkten, beeinflusst wird. In dieser Studie wurde die Maskierungskapazität verschiedener Pufferformulierungen sowie zugelassener pharmazeutischer Produkte untersucht und mit der Pyrogenität des maskierten Endotoxins in diesen Systemen verglichen. Dazu wurden unverdünnten Proben aufgereinigte Endotoxinpräparationen sowie Membranvesikel (OMVs, natürlich vorkommende Endotoxine) unterschiedlicher bakterieller Herkunft zugesetzt und anschließend auf Endotoxinwiederfindung und biologische Aktivität hin analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass isoliertes LPS sowie natürlich vorkommende Endotoxine (NOE) nicht nur in künstlichen Puffersystemen, sondern auch in komplexeren Matrizen zugelassener pharmazeutischer Produkte maskiert werden. Die vorgestellten Daten veranschaulichen die große Abhängigkeit von LER in Bezug auf die Matrixzusammensetzung und die Quelle und den Ursprung des bakteriellen Endotoxins. Zusätzlich werden zwei verschiedene biophysikalische Detektionssysteme auf ihre mögliche Verwendung beim Nachweis von maskiertem Endotoxin untersucht. Neben ersten Hinweisen und vielversprechenden Ergebnissen für ihre allgemeine Anwendung im Endotoxin-Nachweis war es in dieser Studie jedoch nicht möglich, einen funktionellen Test für den Nachweis von maskiertem Endotoxin zu etablieren.