Einsporisolate des Erregers des Asiatischen Sojabohnenrostes <em>(Phakopsora pachyrhizi)</em> zur Charakterisierung der Resistenz gegenüber Demethylierungsinhibitoren

Abstract

Der pflanzenpathogene Pilz <em>Phakopsora pachyrhizi</em> verursacht den Asiatischen Sojabohnenrost (ASR) und stellt insbesondere in Südamerika eine große wirtschaftliche Bedrohung dar. Hier wurden nach erstmaligem Auftreten im Jahr 2001, ohne entsprechende Bekämpfungsmaßnahmen, Ertragsverluste von >80 % dokumentiert. Infolgedessen wurden verstärkt Fungizide eingesetzt, welche bis heute, neben Anbaupraktiken und resistenten Sojasorten, die wichtigste Bekämpfungsstrategie darstellen. Zur Kontrolle des Pilzes werden vor allem Single-Site Fungizide aus den Klassen der Chinon-Outside-Inhibitoren, Succinat-Dehydrogenase-Inhibitoren sowie der Demethylierungsinhibitoren (DMI) eingesetzt. DMI hemmen die Sterol 14&alpha;-Demethylase, ein wesentliches Enzym des Ergosterol-Biosynthesewegs, welches durch das <em>CYP51</em>-Gen des Pilzes kodiert wird. Der starke Selektionsdruck, verursacht durch die intensive Anwendung der DMI, führte zu einer kontinuierlichen Anpassung der Population von <em>P. pachyrhizi</em> unter Feldbedingungen, hin zu einer geringeren Empfindlichkeit gegenüber DMI (Shifting). Diese kontinuierliche negative Verschiebung der Empfindlichkeit (Resistenz) wurde in erster Linie auf die Akkumulation von Mutationen im <em>CYP51</em>-Gen zurückgeführt. Ziel der vorliegenden Studie war es, erstmals mithilfe von Einsporisolaten des biotrophen Pilzes <em>P. pachyrhizi</em>, die Resistenz gegenüber DMI sowie die beteiligten Resistenzmechanismen (v. a. Punktmutationen) zu charakterisieren. Sequenzanalysen des <em>CYP51</em> konnten drei neue Mutationen (V130A, I145V, F154Y) bestätigen, die auf einem DNA-Strang in Kombination mit bereits beschriebenen Mutationen auftreten. Deren Lage im Enzym wurde mithilfe einer Proteinmodellierung aufgezeigt. Nach derzeitigem Kenntnisstand wurden neun Mutationen im <em>CYP51</em> von <em>P. pachyrhizi</em> beschrieben (F120L, V130A, Y131F/H, K142R, I145V/F, F154Y, I475T), welche sich durch die auftretenden Mutationskombinationen in sieben unterschiedliche, adaptierte Haplotypen einteilen lassen. Die in dieser Studie neu identifizierten <em>CYP51</em>-Haplotypen F120L + V130A + Y131F, F120L + Y131H + I145V und F120L + Y131H + F154Y konnten mit unterschiedlichen Sensitivitäten gegenüber DMI in Verbindung gebracht werden. Im Zuge dieser Sensitivitätsstudien wurde erstmals eine unvollständige Kreuzresistenz der Haplotypen F120L + V130A + Y131F und F120L + Y131H gegenüber DMI mit unterschiedlichen chemischen Strukturen nachgewiesen. Des Weiteren wurden in adaptierten Einsporisolaten sechs <em>CYP51</em>-Kopien bestätigt, welche drei unterschiedlichen <em>CYP51</em>-Allelen zugeordnet werden konnten. Diese Allele sind in den Einsporisolaten in unterschiedlichen Verhältnissen vorhanden. Nach bisherigem Kenntnisstand wird hierbei aufgrund möglicher Fitnessnachteile die Anzahl von drei mutierten <em>CYP51</em>-Kopien und somit 50 % Mutationshäufigkeit nicht überschritten. Bei den Einsporisolaten wurde außerdem eine signifikante Überexpression des <em>CYP51</em> festgestellt.

The plant pathogenic fungus <em>Phakopsora pachyrhizi</em> causes Asian soybean rust (ASR) and poses a major economic threat, especially in South America. After the first appearance of the fungus on the continent (2001), yield losses of > 80% were recorded without being subject to control measures. As a result, fungicides were increasingly used, which, besides cultivation practices and resistant soybean varieties, are still the most important control strategy to date. Single-site fungicides from the classes of quinone outside inhibitors, succinate dehydrogenase inhibitors and demethylation inhibitors (DMIs) are mainly used to control the fungus. DMIs inhibit the sterol 14&alpha;-demethylase, an essential enzyme of the ergosterol biosynthetic pathway, which is encoded by the fungal <em>CYP51</em> gene. The strong selection pressure caused by the extensive use of DMIs led to a continuous adaption of the population of <em>P. pachyrhizi</em> under field conditions towards a lower sensitivity against DMIs (shifting). This continuous negative shift in sensitivity (resistance) was primarily attributed to the accumulation of mutations in the <em>CYP51</em> gene. The objective of the present study was to characterize the resistance of <em>P. pachyrhizi</em> to DMIs and the mechanisms involved (especially point mutations) using single spore isolates for the first time. Sequence analyses of <em>CYP51</em> confirmed three new mutations (V130A, I145V, F154Y), which occur on one DNA strand in combination with previously described mutations. Their location in the enzyme was shown using protein modelling. According to current knowledge, nine mutations have been described in <em>CYP51</em> of <em>P. pachyrhizi</em> (F120L, V130A, Y131F/H, K142R, I145V/F, F154Y, I475T), which can be divided into seven adapted <em>CYP51</em>-haplotypes by the occurring mutation combinations. The newly identified haplotypes F120L + V130A + Y131F, F120L + Y131H + I145V, and F120L + Y131H + F154Y in this study could be associated with different sensitivities to DMIs. During these sensitivity studies, incomplete cross-resistance of the haplotypes F120L + V130A + Y131F and F120L + Y131H to DMI with different chemical structures was demonstrated for the first time. Furthermore, six <em>CYP51</em> copies were confirmed in adapted single spore isolates, which could be assigned to three different <em>CYP51</em> alleles. These alleles occur in the single spore isolates in different ratios. According to current knowledge, the number of three mutated <em>CYP51</em> copies and thus 50 % mutation frequency is not exceeded due to possible fitness disadvantages. Significant overexpression of <em>CYP51</em> was also detected in the single spore isolates.