Identification and functional characterization of <em>ENHANCED GRAVITROPISM 2</em> controlling the root setpoint angle in barley (<em>Hordeum vulgare</em> L.)

Abstract

Root gravitropism allows plant roots to penetrate deep into the soil and is one of the main factors determining the root setpoint angle. Understanding the molecular mechanisms underlying the root setpoint angle of crop species can help to reshape root system architecture and to improve adaptation to changing environmental conditions.<br /> The <em>enhanced root gravitropism 2</em> (<em>egt2</em>) mutant was identified in a sodium azide-mutagenized barley population. The mutant shows a steeper root system compared with wild type due to the narrower growth angle of the seminal and lateral roots. Gravistimulation assays showed that the <em>egt2</em> mutant responded faster and stronger to gravity compared to wild type plants. The <em>EGT2</em> gene was mapped and cloned by a combination of bulked-segregant analysis and whole genome sequencing. The candidate gene, which encodes a sterile alpha motif containing protein, was validated by a novel CRISPR/Cas9 mutant allele. Mutations of the two <em>EGT2</em> orthologs in tetraploid durum wheat resulted in a similar hypergravitropic phenotype of the wheat root system as observed in barley, suggesting that the function of EGT2 is evolutionarily conserved.<br /> Root zone-specific transcriptome analyses of gravistimulated wild type roots in a time-course experiment demonstrated that the largest transcriptome changes in response to gravistimulation occurred in the elongation zone, the zone where root gravitropic bending occurs. By comparing <em>egt2</em> and wild type before and after gravistimulation, we demonstrated that 33% of graviregulated genes in the elongation zone were also regulated by <em>EGT2</em>. This suggests that <em>EGT2</em> plays a key role in controlling the molecular network associated with gravitropic bending.<br /> A number of interaction candidates of EGT2 were identified by yeast-two-hybrid screening. Validation of selected proteins encoded by gravity and <em>EGT2</em>-regulated genes by bimolecular fluorescence complementation identified three direct interaction partners of EGT2 that might be involved in cell wall organization and flavonoid metabolism.<br /> In summary, in this study we cloned and characterized <em>EGT2</em>, an evolutionarily conserved regulator of root setpoint angle in barley and demonstrated a substantial role of <em>EGT2</em> in controlling the molecular networks underlying root gravitropic bending in response to gravistimulation.

Wurzelgravitropismus ermöglicht es den Pflanzenwurzeln, tief in den Boden einzudringen, und ist einer der Hauptfaktoren, die den Wurzelansatzwinkel bestimmen. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die den Wurzelansatzwinkel von Nutzpflanzen bestimmen, kann daher dazu beitragen, die Architektur des Wurzelsystems neu zu gestalten, um die Anpassung an sich ändernde Umweltbedingungen, insbesondere an den Klimawandel, zu verbessern.<br /> Die Mutante <em>enhanced root gravitropism 2</em> (<em>egt2</em>) wurde in einer mit Natriumazid mutagenisierten Gerstepopulation identifiziert. Die Mutante weist im Vergleich zum Wildtyp ein steileres Wurzelsystem auf, was auf den geringen Wachstumswinkel der Seminal- und Seitenwurzeln zurückzuführen ist. Gravistimulationsexperimente zeigten, dass die <em>egt2</em> schneller und stärker auf Schwerkraft reagierte als Wildtyp. Das em>EGT2</em>-Gen wurde durch eine Kombination aus BSA (<em>bulked-segregant analysis</em>) und vollständiger Genomsequenzierung kartiert und kloniert. Das Kandidatengen, das für ein Protein mit sterilem Alpha-Motiv kodiert, wurde durch ein neues CRISPR/Cas9-Mutanten-Allel validiert. Mutationen der beiden em>EGT2</em>-Orthologe in tetraploidem Hartweizen führten zu einem ähnlichen hypergravitropischen Phänotyp des Weizenwurzelsystems, wie er in Gerste beobachtet wurde, was darauf schließen lässt, dass die Funktion von EGT2 evolutionär konserviert ist.<br /> Wurzelzonenspezifische Transkriptomanalysen von gravistimulierten Wildtypwurzeln in einem Zeitverlaufsexperiment zeigten, dass die größten Transkriptomveränderungen als Reaktion auf die Gravitationsstimulation in der Elongationszone auftraten, der Zone, in der die gravitropische Biegung der Wurzeln stattfindet. Durch den Vergleich von <em>egt2</em> und dem Wildtyp vor und nach der Gravistimulation konnten wir zeigen, dass 33% der graviregulierten Gene in der Elongationszone ebenfalls durch <em>EGT2</em> reguliert wurden. Dies deutet darauf hin, dass <em>EGT2</em> eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des molekularen Netzwerks im Zusammenhang mit der gravitropischen Biegung spielt.<br /> Eine Reihe von Interaktionskandidaten von EGT2 wurden durch Hefe-Zwei-Hybrid-Screening identifiziert. Bei der Validierung ausgewählter Proteine, die von durch Schwerkraft und <em>EGT2</em> regulierten Genen kodiert werden, durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung, wurden drei direkte Interaktionspartner von EGT2 identifiziert, die an der Zellwandorganisation und dem Flavonoidstoffwechsel beteiligt sein könnten.<br /> Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in dieser Studie den evolutionär konservierten Regulator des Wurzelansatzswinkels <em>EGT2</em> aus Gerste kloniert und charakterisiert haben und dass wir eine wesentliche Rolle von <em>EGT2</em> bei der Kontrolle der molekularen Netzwerke nachgewiesen haben, die der gravitropischen Wurzelbiegung als Reaktion auf Gravistimulation zugrunde liegen.