Characterization of insecticide resistance in Hemipteran crop pests with special reference to aphids and whiteflies

Abstract

Agriculture faces enormous challenges: In addition to the increasing demand for agricultural products with less available agricultural landscapes, there is a need to protect the environment and biodiversity and to minimize climatic emissions. In addition, agricultural food production is challenged by biotic factors as weed, pathogens and insect pests. The green peach aphid <em>Myzus persicae</em>, the pea aphid <em>Acyrthosiphon pisum</em> and the cabbage whitefly <em>Aleyrodes proletella</em> are among the most economically important insect pests worldwide. The one-sided usage of chemical insecticides is often causing insecticide resistance. In the present work, not yet documented insecticide resistance cases of the three pest species could be observed. By bioassays as well as molecular and biochemical diagnostic analyzes, resistance mechanisms were investigated to contribute to a successful integrated pest management. <br /> In the green peach aphid, a 403-fold increase in tolerance to the 'transient receptor potential vanilloid' (TRPV) channel modulator pymetrozine was observed. In two comparative RNA sequencing approaches using Illumina and 'Oxford Nanopore Technology' (ONT) as well as amplicon sequencing using ONT, no mutations in the TRPV channel were detected. In contrast, overexpressed esterases FE4 and E4 as well as cytochrome P450s monooxygenases (CYP, P450s), were uncovered in the pymetrozine resistant strain. In other insects as the cotton whitefly <em>Bemisia tabaci</em>, overexpressed P450s have already led to pymetrozine resistance. The influence of overexpressed esterases and P450s on pymetrozine resistance in <em>M. persicae</em> needs to be elaborated in further studies. <br /> In contrast, a P450 gene, <em>CYP6CY12</em>, could be linked to >180-fold pyrethroid resistance in pea aphids <em>A. pisum</em>. After detecting no relevant mutations in the sodium channel, the target-site of pyrethroids, an over 30-fold overexpression of <em>CYP6CY12</em> was reported by Illumina transcriptome sequencing. UPLC-MS/MS analysis and enzyme kinetic studies provided evidence that deltamethrin is degraded by the protein to its metabolite 4'OH-deltamethrin. In addition to <em></em>, three other CYP6CY P450s are already known which have led to insecticide resistance in aphids. For example, CYP6CY3 which caused resistance to nicotine and neonicotinoids in <em>M. persicae</em>. <br /> In addition to the demonstrated metabolic resistance in pea aphids, target site resistance to spiromesifen and cross-resistance to spirotetramat were uncovered in <em>A. proletella</em>. The A2083V mutation which is located in the CT domain of Acetyl-CoA carboxylase (ACC) was identified by pyrosequencing in several strains from Europe. The mutation already resulted in ketoenol resistance in <em>B. tabaci</em>. <br /> In the present work, important insecticide resistance cases were analyzed and uncovered. The elucidation of insecticide resistance mechanisms provides an important contribution to successful integrated pest management.

Die Landwirtschaft steht aktuell vor großen Herausforderungen: Neben dem steigenden Bedarf an Agrarprodukten bei immer weniger zur Verfügung stehenden landwirtschaftlicher Nutzfläche, sind der Schutz der Umwelt und der Biodiversität sowie die Minimierung von klimaschädlichen Emissionen zu bewältigen. Darüber hinaus wird die Produktion von pflanzlichen Erzeugnissen durch zahlreiche biotische Schadfaktoren wie Unkraut, Pathogene und Schadinsekten gefährdet. Unter den tierischen Schaderregern zählen die Grüne Pfirsichblattlaus Myzus persicae, die Erbsenblattlaus <em>Acyrthosiphon pisum</em> sowie die Kohlmottenschildlaus <em>Aleyrodes proletella</em> zu den ökonomisch bedeutendsten Schadinsekten weltweit. Der Einsatz von Insektiziden führt häufig zu Insektizidresistenzen. In der vorliegenden Arbeit, konnten noch nicht dokumentierte Insektizidresistenzfälle der drei Schädlingsarten beobachten werden. Mittels Biotests sowie molekular- und biochemischen Diagnostikanalysen, wurde versucht die Resistenzmechanismen aufzudecken, um zu einem erfolgreichen integrierten Pflanzenschutz beizutragen. <br /> Bei M. persicae wurde eine 403-fach erhöhte Verträglichkeit des ‘transient receptor potential vanilloid’ (TRPV) Kanal Modulators Pymetrozine beobachtet. In zwei vergleichenden RNA-Sequenzierungsansätzen mittels Illumina und ‘Oxford Nanopore Technology’ (ONT) sowie einer Amplicon-Sequenzierung mit ONT, konnten keine Mutationen im TRPV Kanal nachgewiesen werden. Hingegen wurden überexprimierte Esterasen FE4 und E4 sowie Cytochrom-P450s-Monooxygenasen (CYP, P450s), in dem Pymetrozine resistenten Stamm aufgedeckt. Auch in anderen Insekten, wie der Baumwollmottenschildlaus <em>Bemisia tabaci</em>, führten überexprimierte P450s zu einer Pymetrozineresistenz. Der Einfluss von überexprimierten Esterasen und P450s auf die Pymetrozineresistenz bei M. persicae muss in weiteren Studien erarbeitet werden. <br /> Nachweislich wurde hingegen ein P450 Gen, <em>CYP6CY12</em>, mit einer >180-fachen Pyrethroid-Resistenz bei <em>A. pisum</em> in Verbindung gebracht. Nachdem keine relevanten Mutationen im Natriumkanal, dem Wirkungsort von Pyrethroiden, gefunden wurden, wurde eine >30-fache Überexpression von <em>CYP6CY12</em> mittels Illumina Transkriptom-Sequenzierung analysiert. Eine UPLC-MS/MS Analyse sowie enzymkinetischen Studien erbrachten den Nachweis, dass Deltamethrin durch das Protein zu seinem Metaboliten 4'OH-Deltamethrin abgebaut wird. Neben <em>CYP6CY12</em>, sind bereits drei weitere CYP6CY P450s bekannt, die zu Insektizidresistenzen in Blattläusen geführt haben. Beispielsweise CYP6CY3, welches in M. persicae zu einer Resistenz gegenüber Nikotin und Neonicotinoide führte. <br /> Neben der nachgewiesenen metabolischen Resistenz in <em>A. pisum</em>, konnte eine Wirkortresistenz (Target-Site) gegenüber Spiromesifen sowie die Kreuzresistenz zu Spirotetramat in der <em>A. proletella</em> gefunden werden. Die in der CT-Domäne der Acetyl-CoA carboxylase (ACC) liegende A2083V Mutation wurde mittels Pyrosequenzierung in mehreren Stämmen aus Europa nachgewiesen. Die genannte Mutation führte bereits zu einer Ketoenolresistenz in <em>B. tabaci</em>. <br /> In der vorliegenden Arbeit konnten bedeutsame Insektizidresistenzfälle analysiert und aufgedeckt werden. Die Aufklärung von Resistenzen liefert einen wichtigen Beitrag für einen erfolgreichen integrierten Pflanzenschutz.