Quantitative evaluation of ruminal nutrient degradation using <em>in situ</em> and <em>in vitro</em> methods

Abstract

Quantitative evaluation of ruminal nutrient degradation using <em>in situ</em> and <em>in vitro</em> methods Studies on ruminally cannulated animals are expensive and time consuming. Furthermore they are limited to a few facilities and animal welfare issues make reduced numbers of animal experiments desirable. One alternative is to simulate rumen fermentation using long-term continuous systems, allowing investigation of a large number of treatments in a relatively short period of time. Lack of standardisation of continuous culture systems impairs the comparison of research data. Therefore, the focus of a comprehensive review as one major part of the thesis was to compile and compare technical and other methodical aspects of the semi-continuous culture system ‘rumen simulation technique’ (RUSITEC). Crucial or non-standardised characteristics were highlighted, standardisation of procedures was suggested and limits of standardisation were considered. Procedural steps which were evaluated encompassed choice and feeding of donor animals, type of feeds or rations, sampling time of inoculum and, further, the technical structure and procedure of the RUSITEC systems with a motor, pump, vessels and buffer solution. Moreover, the choice of incubation bags with regard to pore size and material, the incubation time, the experimental run period and the selection of experimental feed have an impact on the results. To improve the comparability of studies, specified technical standards will reduce the variability within and between different models of the RUSITEC system. Finally, standardisations were proposed to reduce variability in the design of simulation systems, variability in the rumen inoculum and to improve the comparability of RUSITEC research data. <br /> Another major objective of the thesis was to directly compare the ruminal fermentation characteristics and degradability of two common forages, i.e., grass silage (GS) and maize silage (MS), by parallel application of a coupled <em>in vivo</em>-<em>in situ</em> approach in rumen-cannulated sheep as well as the <em>in vitro</em> RUSITEC system. Both forages were incubated in the RUSITEC system as well as fed to rumen-cannulated sheep in six independent runs of 20 days in total with 14 days of adaptation and 6 days of sampling. The degradability coefficients of dry matter, organic matter and acid detergent fibre were affected by the method (each P &lt; 0.05), while neutral detergent fibre (aNDFom) degradability was not different between RUSITEC and <em>in situ</em> measurements (P = 0.10). Likewise, Pearson correlation coefficients confirmed the comparability of <em>in vitro</em> and <em>in situ</em> values for aNDFom degradability, being 0.54 (P = 0.04) and 0.78 (P = 0.02) for GS and MS, respectively. Regarding the fermentation profile, total volatile fatty acid (VFA) concentrations were much higher <em>in vitro</em> than <em>in vivo</em> (P &lt; 0.01), likely due to the missing absorptive capacity of the RUSITEC system. <br /> A comparison of absolute fermentation values between methods appears not feasible. However, the order of individual VFA proportions was similar between <em>in vivo</em> and <em>in vitro</em> and the correlations for both total and individual VFA further supported this congruency, especially for MS. The <em>in vitro</em> data appeared well comparable to the data from the coupled <em>in vivo</em>-<em>in situ</em> approach, especially for MS, with a high reproducibility in both methods. <br /> Therefore, the RUSITEC system may represent a sufficient replacement for laborious <em>in vivo</em> and <em>in situ</em> measurements when assessing nutrient degradability and general fermentation characteristics of feedstuffs. Adjustments in <em>in situ</em> incubation times as well as the standardisation of the operation of the RUSITEC system may further increase the significance of this <em>in vitro</em> method in the future. Likewise, further research on diurnal fermentation patterns is encouraged to substantiate the present findings.

<strong>Quantitative Bewertung des Nährstoffabbaus im Pansen mittels <em>in situ</em>- und <em>in vitro</em>-Methoden</strong> <br /> Studien an pansenfistulierten Tieren sind mit einem hohen Kosten- und Zeitaufwand verbunden. Darüber hinaus sind sie nur an wenigen Versuchseinrichtungen möglich und aus Tierschutzgründen ist eine Reduzierung der Anzahl an Tierversuchen grundsätzlich anzustreben. Eine Alternative besteht darin, die Pansenfermentation mithilfe künstlicher Systeme zu simulieren, was u. a. die Untersuchung einer großen Anzahl von Behandlungen in relativ kurzer Zeit ermöglicht. Die mangelnde Standardisierung kontinuierlicher Kultursysteme beeinträchtigt bisher den Vergleich von Forschungsdaten. Daher lag ein Schwerpunkte dieser Arbeit darin, eine umfassende Übersicht zu technischen und methodischen Aspekten des semikontinuierlichen Kultursystems „Pansensimulationstechnik“ (RUSITEC) zu erstellen. Möglichkeiten und Grenzen der technischen und methodischen Vorgehensweise wurden validiert und Vorschläge zu einer Standardisierung erarbeitet. Verfahrensschritte wie die Auswahl und Fütterung der Spendertiere, die Art der Futtermittel bzw. Rationen, der Probenahmezeitpunkt des Inokulums sowie der technische Aufbau und das Handling der RUSITEC-Systeme mit Motor, Pumpe, Gefäßen und Pufferlösung wurden behandelt. Weiterhin hatten die Auswahl der Inkubationsbeutel hinsichtlich Porengröße und -material, die Inkubationszeit, die Versuchslaufzeit und die Auswahl des Versuchsfutters Einfluss auf die Versuchsergebnisse. Um die Vergleichbarkeit von Studien zu verbessern, ermöglichen festgelegte technische Standards, die Variabilität innerhalb und zwischen verschiedenen RUSITEC-Systemen zu reduzieren. Abschließend wurde eine Standardisierung vorgeschlagen, um die Variabilität des RUSITEC-Systems zu vermindern und damit die Vergleichbarkeit der RUSITEC-Daten zu verbessern. Einen weiteren Schwerpunkt bildete der direkte Vergleich der Pansenfermentationseigenschaften und des Nährstoffabbaus durch parallele Anwendung eines gekoppelten <em>in-vivo-in-situ</em>-Ansatzes im Pansen fistulierter Schafe sowie des <em>in-vitro</em>-RUSITEC-Systems. Eingesetzt wurden zwei typische Grobfutter; Grassilage (GS) und Maissilage (MS). Beide Futtermittel wurden in sechs unabhängigen Läufen mit insgesamt 20 Tagen, davon 14 Tage Anpassung und 6 Tagen Probenahme untersucht. Die ruminale Abbaubarkeit der Trockenmasse, der organischen Masse und der Säure-Detergenzien-Faser (ADF) wurden durch die Methode beeinflusst (P < 0,05), während sich die Abbaubarkeit der Neutral-Detergenzien-Faser (aNDFom) zwischen RUSITEC- und <em>in-situ</em>-Messungen nicht unterschied (P = 0,10). Ebenso bestätigten die Pearson-Korrelationskoeffizienten die Vergleichbarkeit der <em>in-vitro</em>- und <em>in-situ</em>-Werte für die aNDFom-Abbaubarkeit; sie betrugen bei GS 0,54 (P = 0,04) und bei MS 0,78 (P = 0,02). Wahrscheinlich aufgrund der fehlenden Absorption im RUSITEC-System waren dia Gesamtkonzentrationen flüchtiger Fettsäuren (VFA) <em>in vitro</em> viel höher als <em>in vivo</em> (P < 0,01). Ein Vergleich absoluter Werte für VFA zwischen den Methoden scheint nicht möglich. Allerdings waren die VFA-Profile <em>in vivo</em> und <em>in vitro</em> ähnlich, und die Korrelationen sowohl für die Summe der VFA als auch für die einzelnen VFA untermauerten diese Kongruenz weiter, insbesondere bei MS. Die <em>in-vitro</em>-Daten waren insgesamt gut mit den Daten des gekoppelten <em>in-vivo-in-situ</em>-Ansatzes vergleichbar, insbesondere für die MS. Das RUSITEC-System kann als ein ausreichender Ersatz für aufwändige <em>in-vivo</em>- und <em>in-situ</em>-Messungen bei der Ermittlung des Nährstoffabbaus und genereller Fermentationseigenschaften von Futtermitteln angesehen werden. Anpassungen der <em>in-situ</em>-Inkubationszeiten sowie die Standardisierung der Verfahrensweisen des RUSITEC-Systems könnten der Anwendung dieser <em>in-vitro</em>-Methode in Zukunft zugutekommen. Ebenso sind weitere Untersuchungen zu diurnalen Fermentationsmustern zu empfehlen, um die vorliegenden Ergebnisse zu festigen.