Untersuchungen zur genetischen Prädisposition von Schweinen gegenüber PRRS

Abstract

Das Porcine Reproduktive und Respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine der wichtigsten viralen Erkrankungen in der weltweiten Schweineindustrie (Balasuriya 2013). Der ätiologische Erreger ist das PRRS Virus (PRRSV) (Balasuriya 2013, Conzelmann et al. 1993). Die Einflussnahme von genetischen Elementen und Funktionen auf die Immunreaktion post PRRSV ist noch unklar. Hauptziele dieser Studie sind, das globale Transkriptomprofil von PRRSV infizierten Lungen-DCs mittels RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) von zwei unterschiedlichen Schweinerassen (Piétrain und Duroc) zu charakterisieren und Gründe für die ineffektive Immunreaktion von Schweinen post PRRSV Infektion als auch Veränderungen im Expressionsprofil von unterschiedlichen respiratorischen Zellen nach der Virusinfektion zu ermitteln. Für das in vitro Infektionsmodell wurden sechs weibliche, 30 Tage alte Ferkel von zwei unterschiedlichen Schweinerassen (Piétrain und Duroc) ausgewählt. Alveolarmakrophagen (PAMs), dendritische Zellen (Lungen-DCs) und Epithelzellen aus der Trachea wurden von allen Versuchstieren isoliert. Die Zellcharakterisierung der PAMs und der Lungen-DCs erfolgte mittels der Durchflusszytometrie und die der Tracheaepithelzellen mittels Immunfluoreszenz Assay. Alle respiratorischen Zellen wurden mit dem europäischen PRRSV Stamm Lelystad Virus (LV) infiziert. Nicht-infizierte (0 h) und infizierte (3, 6, 9, 12 und 24 hpi) Lungen-DCs, PAMs und Trachea-Epithelzellen wurden gesammelt. Nach der RNA Isolierung folgte die Qualitätsbestimmung der RNA mittels Bioanalyzer. Zur RNA-Seq wurden nicht-infizierte (0 h) und infizierte (3, 6, 9, 12 und 24 hpi) Lungen-DCs beider Schweinerassen eingesetzt. Das Sequenz-Alignment erfolgte mit dem aktuellen Referenzgenombild Suscrofa 10.2 und mit dem kompletten Genom des LV Stammes. Die Transkriptom-Analyse von PRRSV infizierten Piétrain und Duroc Lungen-DCs charakterisierte 20.396 porcine Gentranskripte. Durch die globale Transkriptomanalyse wurden frühe, temporal verschiedene und konträre Immunreaktionen in PRRSV infizierten Lungen-DCs (Piétrain & Duroc) identifiziert. Das Virus-Sequenz-Alignment zeigte, dass der LV Stamm sowohl Piétrain und Duroc Lungen-DCs infizieren als auch sich dort replizieren kann. Nach der PRRSV Infektion konnten Rassenunterschiede (Piétrain und Duroc) in der Reaktion auf eine PRRSV Infektion festgestellt werden, sowohl beim Viruswachstum als auch in identifizierten mRNA Expressionsprofilen und bei den unterschiedlich exprimierten Genen. Zudem konnten zellspezifischen Reaktionsunterschiede auf PRRSV in den verschiedenen respiratorischen Zelltypen (Lungen-DCs, PAMs und Trachea-Epithelzellen) durch die Expressionsprofil-Analyse der selektierten Kandidatengene charakterisiert werden. Zusätzlich wurden 37 Cluster für Piétrain, 35 für Duroc sowie entscheidende Schlüssel- Cluster und Schlüssel-Signalwege identifiziert.

The porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most important viral diseases of the swine industry worldwide (Balasuriya 2013). Its aetiological agent is the PRRS virus (PRRSV) (Balasuriya 2013, Conzelmann et al. 1993). The understanding of the genetic elements and functions, involved in the immune response to PRRSV, remains still unclear. The main objectives of this study are to characterize the global transcriptome profile of PRRSV infected lung DCs, by using the RNA-Sequencing (RNA-Seq), to identify causes of the ineffective immune response to PRRSV as well as to determine changes in the expression profile in different respiratory cells post PRRSV infection. For the in vitro investigations six female 30 days old piglets of two different porcine breeds (Pietrain and Duroc) were selected, pulmonary alveolar macrophages (PAMs), lung dendritic cells (lung DCs) and trachea epithelial cells were isolated and infected with the European prototype PRRSV strain Lelystad virus (LV). The cell characterization of the lung DCs and PAMs was carried out by using a flow cytometric analysis, for trachea-epithelial cells the cell characterization was done by an immunofluorescence assay. Non-infected (0 h) and infected (3, 6, 9, 12 and 24 hpi) lung DCs, PAMs and trachea epithelial cells were collected. After the RNA isolation the RNA quality was measured by Bioanalyzer. Non-infected (0 h) and infected (3, 6, 9, 12 and 24 hpi) lung DCs of both breeds were used for RNA-Seq. The sequence alignment was done with the reference genome build Suscrofa 10.2 and with the complete genome of LV strain. The transcriptome analysis of PRRSV infected lung DCs of Pietrain and Duroc resulted in an amount of 20,396 porcine predicted gene transcripts. Through the global transcriptome analysis early temporal, different and contrary immune reactions in PRRSV infected lung DCs (Pietrain & Duroc) were identified. The virus sequence alignment exhibited that the LV strain was able to infect Pietrain and Duroc lung DCs and to replicate there. Not only breeddifferences (Pietrain und Duroc) post PRRSV infection in the virus growth, also breeddifferences in the detected mRNA expression profiles and in the differently expressed genes were identified. Beside these breed-dependent differences, respiratory cell-type (lung DCs, PAMs, trachea-epithelial cells) dependent differences in the response to PRRSV were characterized. 37 clusters for Pietrain and 35 clusters for Duroc as well as important key clusters and key pathways were identified.