Reduzierung der Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen durch gezielte Hygiene-Maßnahmen

Abstract

In der vorliegenden Studie sollte der Zusammenhang zwischen einer erhöhten Zelldichte in Melkanlagen-Biofilmen und der vermehrten Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen über horizontalen Gentransfer überprüft werden. Hierfür wurden Tupferabstriche von verschiedenen Stellen innerhalb einer Melkanlage genommen und mit Hilfe einer Kombination aus kultivierungsgestützten und molekularbiologischen Verfahren untersucht. Zusätzlich wurden mit den gewonnenen antibiotikaresistenten Isolaten aus der Melkanlage Mating-Experimente durchgeführt, um die horizontale Übertragbarkeit der nachgewiesenen Resistenzgene in vitro zu überprüfen. Die Auswahl der Stellen zur Tupferprobenahme erfolgte anhand von bisherigen Arbeiten, in denen bereits Stellen mit vermehrt auftretender Biofilmbildung in der untersuchten Melkanlage erfasst wurden. Die getesteten Antibiotika wurden aufgrund der Häufigkeit ihres Einsatzes in dem untersuchten Milchviehhaltungsbetrieb ausgewählt. Während die kultivierungsgestützten Methoden in der Arbeitsgruppe bereits etabliert waren, wurden verschiedene RT-qPCR-Reaktionen für den molekularbiologischen Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen neu etabliert. Insbesondere die PMA-Behandlung des Mastermixes vor dem Einsatz universeller Primer zum Nachweis der 16S rRNA-Gene erwies sich als geeignet zur Erzielung geringer Nachweisgrenzen durch Unterdrückung von Signalen in der Negativkontrolle. In der vorliegenden Studie wurde ein klarer Zusammenhang zwischen dem therapeutischen und präventiven Einsatz der getesteten Wirkstoffe zur Behandlung der Milchkühe und dem Auftreten entsprechender Resistenzen bestätigt. Gegen alle vier getesteten Antibiotika Cloxacillin, Ampicillin, Penicillin und Tetracyclin wurden Keimzahlen resistenter Mikroorganismen kulturell ermittelt. Der molekularbiologische Nachweis der Antibiotikaresistenzen gestaltete sich aufgrund der hohen Vielfalt entsprechender Resistenzgene und –gengruppen deutlich schwieriger. So wurden von den vier getesteten β-Lactamasegenen (blaZ, OXA-1, -2, und -10) lediglich OXA-2 Gene in den Tupfer-DNAExtrakten der Melkbecherablagen als am stärksten besiedelten Ort der Melkanlage detektiert. Im Gegensatz dazu wurden tetM-Gene in den DNA-Extrakten aller Tupferprobenahmeorte detektiert. Insgesamt konnte weder molekularbiologisch noch kulturell ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Besiedelungsdichte und der Häufigkeit des Auftretens von Antibiotikaresistenzen festgestellt werden. Folglich spielen vermutlich weitere Faktoren neben der Besiedelungsdichte eine Rolle für die Verbreitung von Resistenzgenen innerhalb von Biofilmen. Mit den zugewendeten Projektmitteln wurde eine zweijährige Doktorandenstelle finanziert. Zusätzlich wurden die Zuschüsse zur Anschaffung von Verbrauchsmaterial, insbesondere für die molekularbiologischen Verfahren, verwendet. Außerdem wurden die Kosten für die Teilnahme an einer internationalen Tagung in Valencia (Spanien) getragen, auf der die Ergebnisse des Projektes anhand einer Posterpräsentation vorgestellt wurden.

The present study was conducted to test the interconnection between microbial cell density and appearance and horizontal transfer of antibiotic resistance genes in milking machine biofilms. Swab samples were taken from different parts of the milking machine and were investigated by a combination of cultivation and molecular methods including RT-qPCR detection of antibiotic resistance genes. Moreover, horizontal transferability of the detected antibiotic resistance genes was tested by in vitro mating experiments between resistant milking machine isolates and suitable sensitive recipients. The sampling sites were chosen according to earlier studies which revealed parts of the milking machine where biofilm formation takes place. The antibiotics tested were chosen according to their frequency of use on the investigated farm. While the cultivation techniques were already well established in the laboratory, the molecular methods, especially RT-qPCR reactions for the detection of 16S rRNA and antibiotic resistance genes, were newly established in the present study. This included PMA-treatment of mastermixes prior to use of universal 16S rRNA gene primers to exclude false positive signals from negative controls, which resulted in improved detection limits. The study showed a clear interconnection between the frequency of use of antibiotics in the investigated farm and the detection of antibiotic resistant biofilm inhabitants. Especially in the cultivation approach, bacterial counts were detected on agar media containing the four tested antibiotics cloxacillin, ampicillin, penicillin and tetracyclin. Cultivation counts were especially high on cloxacillin containing agar, an antibiotic used prophylactically at dry off. The molecular detection of antibiotic genes was difficult due to the high diversity of different resistance genes. While of the four tested β-lactamase genes (blaZ, OXA-1, -2, -10) only OXA-2 genes were detected only at the milking equipment retainers, tetM genes were detected in the DNA extracts of all swab samples. However, a clear relationship between biofilm cell density and frequency of appearance of antibiotic resistance genes could not be established. We concluded that additional factors must play a role in horizontal gene transfer frequency. The financial resources received were used to finance a two-year PhD-position, to purchase consumables, especially for the molecular methods, and for the participation on an international conference in Valencia (Spain) where the results of the study were presented in a poster presentation.