Functional characterization of inositol pyrophosphate pyrophosphatases in plants

Abstract

The consequences of the climate and biodiversity crisis present an increasingly challenge for the agricultural sector to ensure food security for a growing world population. The optimal nutrient supply of plants is a critical factor in maintaining or increasing yields, especially of essential macronutrients such as phosphorus (P). It is therefore important to gain a deeper understanding of the processes involved in P uptake, in form of inorganic phosphate (P_i), and the mechanisms regulating P_i homeostasis in plants. Recent research has identified the involvement of the signaling molecules inositol pyrophosphates (PP-InsPs) in the process of P_i signaling and homeostasis in plants. The biosynthesis of PP-InsPs relies on balanced phosphorylation and dephosphorylation of inositol phosphates (InsPs) and PP-InsPs. However, the current state of knowledge regarding PP-InsP dephosphorylation is notably limited in comparison to InsP/PP-InsP phosphorylation. Therefore, the objective of this thesis was to identify and characterize putative PP-InsP pyrophosphatases in plants. We found that recombinant proteins of all five Arabidopsis Plant and Fungi Atypical Dual Specificity Phosphatases (PFA-DSP1-5) display pyrophosphatase activity with a high specificity for the 5 β-phosphate of PP-InsPs. Heterologous expression in <em>Nicotiana benthamiana</em> leaves provided evidence that Arabidopsis PFA-DSP1 also displays a 5-β-phosphate-specific PP-InsP pyrophosphatase activity <em>in planta</em>. Moreover, we identified a family of Arabidopsis NUDIX hydrolases (NUDTs) that group into two closely related subclades. Through <em>in vitro</em> assays, heterologous expression systems, and higher-order gene-edited mutants, we found that subclade I NUDTs preferentially hydrolyze 4-InsP₇, while subclade II NUDTs target 3-InsP₇. In higher-order mutants of subclade II NUDTs, we observed defects in both P_i and iron homeostasis, accompanied by increased levels of 1/3-InsP₇ and 5-InsP₇. Ectopic expression of NUDTs from both subclades induced local P_i starvation responses (PSRs), while RNA-seq analyses comparing WT and <em>nudt12/13/16</em> loss-of-function plants indicate additional PSR-independent roles and a potential involvement of 1/3-InsP₇ in the regulation of plant defense. <br> Collectively, the results presented in thesis show not only new insights into the roles of PFA DSPs and NUDTs in regulating PP-InsP signaling pathways in plants, but also provide the genetic tools to uncover more general roles of PP-InsPs in plant physiology and plant development.

Die Ernährungssicherung einer wachsenden Weltbevölkerung wird durch die Folgen der Klima- und Biodiversitätskrise zu einer zunehmenden Herausforderung für den Agrarsektor. Eine optimale Nährstoffversorgung der Pflanzen, vor allem mit essenziellen Makronährstoffen wie Phosphor (P), ist entscheidend für die Aufrechterhaltung oder Steigerung der Erträge. Um die Aufnahmeeffizienz von P, in Form von anorganischem Phosphat (P_i), zu erhöhen, ist es wichtig die Mechanismen zu verstehen, welche die P_i-Homöostase in Pflanzen regulieren. Aktuelle Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass die Signalmoleküle Inositolpyrophosphate (PP-InsPs) an den Prozessen der P_i-Homöostase in Pflanzen beteiligt sind. Obwohl die Biosynthese von PP-InsPs auf einer ausgewogenen Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Inositolphosphaten (InsPs) und PP-InsPs basiert, ist der Kenntnisstand über die Dephosphorylierung von PP-InsPs limitiert. Das Ziel dieser Arbeit war es, PP-InsP Pyrophosphatasen in Pflanzen zu identifizieren und zu charakterisieren. Mit <em>in vitro</em> Analysen und der heterologen Expression von Arabidopsis Plant and Fungi Atypical Dual Specificity Phosphatases (PFA-DSPs) in Hefen und Tabak haben wir gezeigt, dass diese Enzyme eine PP InsP Pyrophosphatase Aktivität mit einer hohen Spezifität für das 5-β-Phosphat aufweisen. Darüber hinaus haben wir sieben Arabidopsis NUDIX-type (NUDT) Hydrolasen identifiziert, die eine PP-InsP Pyrophosphatase Aktivität aufweisen und sich im phylogenetischen Baum in zwei Untergruppen einteilen lassen. Mit Hilfe von <em>in vitro</em> Analysen, heterologen Expressionssystemen und Gen-Knockout-Mutanten fanden wir heraus, dass die Gruppe I NUDT Hydrolasen bevorzugt 4-InsP₇ hydrolysieren, während Gruppe II NUDT Hydrolasen eine Spezifität für 3-InsP₇ aufweisen. In der Arabidopsis dreifach Knockout-Mutante <em>nudt12/13/16</em> haben wir Defekte in der P_i- und Eisen-Homöostase beobachtet, zusammen mit erhöhten 1/3-InsP₇ und 5-InsP₇ Konzentrationen. Darüber hinaus zeigte die heterologe Expression von Arabidopsis NUDT Hydrolasen aus beiden Gruppen eine lokale P_i-Defizit Reaktion (PSR) in Tabakblättern. Die Transkriptomanalyse der Mutante <em>nudt12/13/16</em> lieferte zudem Hinweise darauf, dass PP-InsPs auch an PSR-unabhängigen Prozessen beteiligt sein könnten, wie beispielsweise 1/3-InsP₇ an der Regulierung der Pflanzenabwehr. <br> Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse liefern nicht nur neue Erkenntnisse über die Rolle von PFA-DSPs und NUDTs bei der Regulierung von PP-InsP-Signalwegen in Pflanzen, sondern auch das genetische Werkzeug, um allgemeinere Rollen von PP-InsPs in der Pflanzenphysiologie und Pflanzenentwicklung zu erforschen.