Molekularpharmakologische Analyse des P2Y₁₂-Rezeptor-Antagonisten Elinogrel

Abstract

Der humane P2Y12-Rezeptor (hP2Y12R) spielt eine Schlüsselrolle bei der Thrombozytenaggregation und ist eine der wichtigsten pharmakologischen Zielstrukturen für klinisch im Rahmen der Prävention und Therapie von thrombotischen Erkrankungen eingesetzte Aggregationshemmer. Es handelt sich um einen Gi-Protein-gekoppelten Rezeptor, der bei Aktivierung zu einer Senkung der intrazellulären Konzentration von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) führt und hierdurch schließlich die Sekretion und Adhäsion von Thrombozyten hemmt. Zu seinen Liganden gehört Elinogrel, ein direkter, reversibler P2Y12-Antagonist, dessen Entwicklung als Pharmakon nach klinischen Phase-II Studien wegen unerwünschter Blutungsereignisse beendet wurde.<br /> In dieser Arbeit erfolgten Untersuchungen zur Bindung und Affinität von Elinogrel am hP2Y12R mithilfe von ovariellen Zellen des Chinesischen Hamsters, die entweder ein Fusionsprotein aus dem hP2Y12R und dem verstärkt cyan fluoreszierenden Protein (ECFP), die Wildtyp-Variante des hP2Y12Rs oder eine K280A-mutierte Variante exprimierten. Nach einer initialen Expressionsanalyse konnte der Forskolin-induzierte Anstieg der cAMP-Konzentration mithilfe des AlphaScreen®-cAMP-Assays (PerkinElmer) bestimmt und hieraus Konzentrations-Wirkungs-Kurven verschiedener Agonisten erstellt werden – ohne oder unter Einfluss von Elinogrel. Anhand dieser Daten erfolgten dann Schildplot-Analysen.<br /> Die Expressionsanalyse ergab ein vornehmliches Vorkommen des Rezeptors in der Zellmembran, das am hP2Y12R-ECFP-Konstrukt durch 2-Methylthioadenosindiphosphat (2-MeSADP) gesteigert werden konnte. In den cAMP-Versuchen erwies sich 2-MeSADP als deutlich potenter als der endogene Agonist Adenosindiphosphat (ADP) und es konnte eine wahrscheinliche Beteiligung der Aminosäure K280 bei der Bindung von 2-MeSADP nachgewiesen werden. Am nicht-mutierten Rezeptor führten steigende Konzentrationen von Elinogrel zu einer zunehmend parallelen Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurven und die Schildplot-Analysen ergaben Geraden mit einer Steigung von m=1. Diese Ergebnisse weisen insgesamt auf einen rein kompetitiven Wirkmechanismus von Elinogrel hin. Es zeigte sich eine starke Affinität mit einem pA2-Wert von 8,74 am nicht-mutierten Rezeptor.