Rotverschiebung der spektralen Empfindlichkeit der lichtsensitiven Ionenkanäle ChR2 und ReaChR durch enzymatische Vitamin-A₂-Produktion

Abstract

Optogenetik bezeichnet eine Forschungsmethode, bei der lichtempfindliche Rezeptoren (Photorezeptoren) in spezifische Zellen oder Organe eingebracht werden, um mithilfe von Licht und damit verbundener zeitlicher und räumlicher Präzision molekulare Prozesse zu untersuchen und zu steuern. Eine Vielzahl optogenetischer Proteine mit unterschiedlichen Funktionen, wie Ionenkanäle, Pumpen und Rezeptoren, wurde entwickelt und wird in verschiedensten Forschungsbereichen genutzt. Der Lichtwellenlängenbereich, der eine Aktivierung der optogenetischen Proteine auslöst, liegt oft im blau-grünen Wellenlängenbereich. Für die Anwendung optogenetischer Methoden in vivo ist jedoch eine Aktivierbarkeit der Rezeptoren mit rötlichem Licht von großer Bedeutung, da rotes Licht, im Gegensatz zu blau-grünlichem Licht, Gewebe deutlich besser durchdringen kann und mit weniger Phototoxizität einhergeht. Die spektrale Empfindlichkeit von Photorezeptoren wird durch den Chromophor festgelegt, der in Säugetieren aus Vitamin A₁ besteht. Durch die Verwendung von Vitamin A₂ statt Vitamin A₁ als Chromophor kann die spektrale Empfindlichkeit eines Photorezeptors in rötlichere Lichtwellenlängenbereiche verschoben werden. Cyp27c1 ist ein Enzym aus der Cytochrom-P450-Gruppe, das durch die Umwandlung von Vitamin A₁ in Vitamin A₂ in den Sehpigmenten von bestimmten Fischen ein erweitertes Sehspektrum im rotverschobenen Bereich ermöglicht. In dieser Arbeit konnte ich Cyp27c1 erstmalig als optogenetische Methode anwenden und zeigen, dass die enzymatische Umwandlung von Vitamin A₁ zu Vitamin A₂ durch Cyp27c1-Expression in HEK-293 Zellen zu einer Rotverschiebung der spektralen Empfindlichkeit des lichtgesteuerten Ionenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) und seiner rotverschobenen Variante ReaChR führt. Dazu habe ich mit Patch-Clamp-Technik die Photoströme von ChR2 oder ReaChR in HEK293-Zellen bei verschiedenen Wellenlängen gemessen und die spektrale Empfindlichkeit analysiert. Die Inkubation von HEK293-Zellen mit Vitamin A₂ führte zu einer Rotverschiebung der Wellenlänge mit halbmaximalen Strömen (λ50%) um 6,8 nm für ChR2 und 12,4 nm für ReaChR. Cyp27c1-GFP wurde in HEK293-Zellen exprimiert, eine mitochondriale Lokalisation von Cyp27c1 gezeigt und mittels HPLC-Analyse eine Umwandlung von Vitamin A₁ in Vitamin A₂ durch Cyp27c1 nachgewiesen. Bei gleichzeitiger Expression von Cyp27c1 und ChR2 waren die Photoströme bei 550 nm etwa doppelt so hoch im Vergleich zur Kontrolle ohne Cyp27c1-Expression und λ50% wurde um 10,5 nm ins Rötliche verschoben. In ReaChR verschob Cyp27c1 λ50% um 14,3 nm und erhöhte die Photoströme bei 650 nm knapp um das Dreifache. Da das Hinzugeben von Vitamin A₂ für die Optogenetik in vivo keine praktikable Option ist und die Expression von Cyp27c1 zu einer geringfügig besseren Rotverschiebung geführt hat, ist die Expression von Cyp27c1 eine vielversprechende Strategie zur Rotverschiebung der spektralen Empfindlichkeit optogenetischer Rezeptoren.