Entwicklung von Orthoflavivirus-Replikonpartikeln für den Nachweis neutralisierender Antikörper

Abstract

Orthoflavivirusinfektionen stellen eine relevante Belastung für die Weltgesundheit dar. Viele Orthoflaviviren werden von Vektoren wie Stechmücken und Zecken auf den Menschen übertragen. Sie können mitunter Infektionen mit schweren Verläufen zur Folge haben und zu endemischen Ausbrüchen führen. Eine schnelle und zuverlässige Diagnostik ist im Falle solcher Ausbrüche unabdingbar. Aufgrund der Kreuzreaktivität unter den serologischen Antikörpern gegen die verschiedenen Orthoflaviviren ist der Neutralisationstest (NT) Methode erster Wahl in der Diagnostik. In dieser Arbeit wurden Virus-Replikonpartikel (VRPs) basierend auf einem Gelbfiebervirus (YFV) Replikon mit einer sekretierten Gaussia-Luciferase (GLuc) als Reporter entwickelt, die in einem einmaligen Infektionszyklus für NTs verwendet werden können. Das Replikon wurde durch wildtypische (YFV) oder chimärische (Dengue-Virus [DENV], Zika-Virus [ZIKV]) Orthoflavivirus-Strukturproteine verpackt, die <em>in trans</em> über Verpackungskonstrukte exprimiert wurden. Die Verpackungsvektoren basieren auf einem doppelt subgenomischen Sindbis-Virus (SINV) Replikon. Sie exprimieren die unterschiedlichen prME-Hüllproteine unter dem ersten und das YFV Capsid-Protein unter dem zweiten subgenomischen SINV-Promotor. Durch entsprechende Restriktionsschnittstellen ließ sich die prME-Kassette des Vektors durch die verschiedener Orthoflaviviren austauschen, sodass die chimärischen Konstrukte einfach kloniert werden konnten. Die VRPs wurden durch Co-Elektroporation der <em>in vitro</em> transkribierten RNAs von Replikon und Verpackungsplasmid mit anschließender Inkubation der elektroporierten Zellen für 72 h bei 32 °C generiert. Die Ernte erfolgte aus dem Zellüberstand. Im Rahmen dieser Arbeit wurden VRPs mit den Oberflächenproteinen von YFV, DENV-1–4 und ZIKV hergestellt, die das YFV-GLuc Replikon enthielten. Sie wurden auf ihre Funktionalität und Anwendbarkeit im NT mit verschiedenen humanen Antiseren und monoklonalen Antikörpern überprüft und die Methode mit dem gängigen Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) verglichen. Die Auswertung der VRP-basierten NTs erfolgte im 96-Well-Format über Analyse der GLuc-Aktivität am Plattenluminometer. Die Untersuchungen zeigten, dass die etablierten NTs für Hochdurchsatzanalysen von neutralisierenden Orthoflavivirus-Antikörpern geeignet sind.