Nitric oxide synthase (NOS) genes expression in cattle in vitro produced embryos

Abstract

This study was conducted to determine whether NOS-NO affects oocytes meiotic maturation and embryo development <i>in vitro</i> in bovine, to profile the temporal expression pattern of NOS genes, then to detect and localize the protein products of iNOS and eNOS in preimplantation developmental stages. Cumulus-oocyte complexes and one-cell embryo were incubated in maturation or/and culture media without or with different doses of L-NAME, an inhibitor of NO. End point was blastocyst rate but cleavage rate was examined also. No significant effect of the inhibitor was obtained when oocytes were matured in presence of L-NAME as indicated by a blastocyst rate of 28 ± 14 %, 19 ± 15 % and 22 ± 11 % at 0, 1 and 10 mM respectively. However, high levels of arrested blastocyst rates were indicative of an impairment of normal development. At culture, L-NAME inhibited embryo development at 10 mM, significantly (p = 0.05) compare to control group (blastocyst rates of 1 ± 2 % at 10 mM against 15 ± 10 % at 0 mM). The inhibitory effect was reduced when L-NAME was decreased to 0.1 or 1 mM. Similar result was observed after application of the inhibitor in maturation and culture media. The application of the inhibitor had no effect on the cleavage rates either at maturation, culture or both at any concentration compared to the control group. In maturation, 71 ± 11 %, 63 ± 13 % and 63 ± 11 % cleavage rates have been obtained at 0, 1 and 10 mM L-NAME respectively. Using real-time RT PCR, the iNOS and eNOS genes were found well expressed in oocytes, 2C and 4C embryos but were far less prevalent in other developmental stages, except iNOS at blastocyst stage. Their expression levels were low in mature oocytes compare to immature oocytes. The absence of quantifiable eNOS or iNOS at 8C and morulae was in contradiction to the qualitative identification. Neuronal NOS mRNA was measurable only in immature oocytes, 4C and morulae stages. NOS proteins detected by immunohistochemistry were localized in cytoplasm of oocytes to blastocyst stages with a weak staining in the nuclei. In germinal vesicle-stage oocytes, the immunoreactivity was localized in the ooplasm but after GVBD, it mostly accumulated around the condensed chromosomes. Our results show for the first time all three NOS profiles, confirming that NO is synthesized from different isoforms to ensure bovine preimplantation development, and also their proteins are detectable by using immunofluorescence staining.

<b>Untersuchung der Expression von Nitric Oxid Synthase (NOS) Genen in in vitro erzeugten Rinderembryonen</b><br /> Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Rolle von NO in bovinen Oozyten und während der Entwicklung der Embryonen im präimplantativen Stadium zu untersuchen, das temporale Expressionsmuster der NOS Gene in den präimplantativen Entwicklungsstadien zu identifizieren und die Protein Produkte von iNOS und eNOS während dieser Zeit zu finden und lokalisieren. Kumulus-Oozyten Komplexe und Einzell- Embryonen wurden in Maturations- und/oder Kulturmedium ohne/mit unterschiedlichen Mengen von L-NAME, einem NO Inhibitor, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Blastozystenrate und ebenfalls die Teilungsrate festgestellt. Es wurden keine signifikanten Effekte des Inhibitors bei der Maturation der Oozyten mit L-NAME im Medium festgestellt. Bei der Kultivierung unterdrückt L-NAME die Embryoentwicklung bei 10 mM signifikant (p=0,05) verglichen mit der Kontrollgruppe (Blastozystenraten von 1 ± 2 % bei 10 mM verglichen mit 15 ± 10 % bei 0 mM). Dieser Effekt wurde verkleinert, wenn L-NAME auf 0,1 oder 1 mM reduziert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Zugabe des Inhibitors in Maturations- und Kulturmedium beobachtet. Die Zugabe des Inhibitors hatte keinen Effekt auf die Teilungsrate weder bei der Maturation, Kultur oder beiden. Bei der Maturation wurde eine Teilungsrate von 71 ± 11 %, 63 ± 13 % bis 63 ± 11 % bei jeweils 0, 1 und 10 mM L-NAME beobachtet. Mit der Real-Time RT PCR Technik wurde festgestellt, dass die iNOS und eNOS Gene in Oozyten, 2-Zell und 4-Zell Embryonen gut exprimiert waren, jedoch weniger stark in anderen Stadien mit der Ausnahme von iNOS im Blastozystenstadium. Das Expressionsniveau war in maturierten Oozyten verglichen zu immaturen Oozyten niedrig. nNOS war in Oozyten, 4-Zelenl und Morulaes Embryonen exprimiert. NOS Proteine wurden im Cytoplasma der Oozyten bis zu den Blastozystenstadien mit einer schwachen Färbung im Zellkern lokalisiert. <br /> Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten Mal alle drei NOS Expressionsprofile in preimplantativen Rinderembryonen, was bestätigt, dass NO aus drei verschiedenen Isoformen synthetisiert wird, welche die bovine präimplantative Entwicklung beeinflussen.