mRNA expression of the acute phase protein haptoglobin in blood and milk somatic cells and cellular localisation within the mammary gland of dairy cows

Abstract

The haptoglobin (Hp) concentration in blood and milk is increasingly discussed as a diagnostic marker for bovine mastitis. This acute phase protein is mainly synthesised in the liver, however, Hp mRNA was also discovered in tissue homogenates of the bovine mammary gland. The aim of this study was to advance this finding by allocating Hp mRNA expression within the bovine mammary gland at the cellular level. Possible candidates are, firstly, cells of the mammary gland itself and, secondly, circulating leukocytes infiltrating the udder. The presence of the Hp mRNA in the latter cells was investigated by RT-PCR carried out with RNA extracted from bovine blood leukocytes as well as from milk somatic cells. In order to localise Hp mRNA expression at the cellular level within the mammary gland a protocol for in situ hybridisation was developed. Subsequently, this was applied to bovine mammary tissues infected with <i>Escherichia coli (E. coli) </i>or<i> Staphylococcus aureus (Staph. aureus)</i> by intracisternal inoculation 0, 6, 12 or 24 h pre-slaughter. In addition, blood and milk samples from these cows were analysed for the concentration of Hp protein collected during the 24 h infection and immediately pre-slaughter, respectively. In comparison to cattle, human leukocytes and mammary gland tissue were evaluated for Hp mRNA by RT PCR, because of existing, however contradicting evidence on Hp expression in man. <br /> The results demonstrate that Hp mRNA is present in bovine leukocytes as well as milk somatic cells. Within the bovine mammary gland Hp mRNA expression could generally be assigned to the alveolar epithelial cells. In addition, <i>E. coli</i> pathogens caused a marked upregulation of Hp mRNA expression within hours after start of infection, whereas Hp mRNA expression in response to <i>Staph. aureus</i> infection appeared unchanged during the initial 24 h post-infection. These differences in mRNA presence between the pathogen types were matched by Hp protein concentrations measured in blood and milk. In humans, Hp mRNA was also evident in the mammary gland and in 50% of the leukocytes samples tested. In conclusion, this study identified novel cellular sites of Hp mRNA expression in dairy cows and, thus, possible sources of the Hp protein found in milk.

<strong>mRNA Expression des Akute Phase Proteins Haptoglobin in Blut- und Milchzellen sowie zelluläre Lokalisation im Euter von Milchkühen</strong><br /> Die Konzentration von Haptoglobin (Hp) in Blut und Milch wird als diagnostischer Marker für die Mastitis des Rindes zunehmend diskutiert. Dieses Akute Phase Protein wird hauptsächlich in der Leber synthetisiert, jedoch konnte Hp mRNA auch in Gewebehomogenaten der bovinen Milchdrüse nachgewiesen werden. Auf diesem Ergebnis aufbauend war das Ziel dieser Studie, die Hp mRNA Expression innerhalb der bovinen Milchdrüse auf zellulärer Ebene zuzuweisen. Dafür in Frage kommen einerseits Zellen der Milchdrüse selbst und andererseits Leukozyten, die aus dem Blut in das Euter einwandern. Um die Präsenz von Hp mRNA in den letztgenannten Zellen zu untersuchen, wurde mit RNA aus bovinen Blutleukozyten und aus Milchzellen eine RT-PCR durchgeführt. Zur zellulären Lokalisierung der Hp mRNA Expression in der Milchdrüse wurde ein Protokoll für eine in situ Hybridisierung entwickelt. Mit diesem Protokoll wurde anschließend Milchdrüsengewebe von Kühen untersucht, welches 0, 6, 12 oder 24 h vor der Schlachtung durch intrazisternale Applikation mit <i>Escherichia coli (E. coli) </i>oder<i> Staphylococcus aureus (Staph. aureus)</i> infiziert wurde. Zusätzlich wurde die Hp-Proteinkonzentration in Blut- und Milchproben gemessen, die diesen Kühen während der 24-stündigen Infektion bzw. unmittelbar vor der Schlachtung genommen worden waren. Im Vergleich zum Rind wurden wegen bereits bestehender, aber widersprüchlicher Angaben zur Hp Expression beim Menschen zudem Leukozyten und Milchdrüsengewebe des Menschen mittels RT-PCR auf Hp mRNA getestet.<br /> Die Ergebnisse zeigen, dass Hp mRNA in bovinen Leukozyten und Milchzellen vorhanden ist. Im Euter konnte die Hp mRNA Expression den Zellen des Alveolarepithels zugeordnet werden. Zusätzlich zeigte sich, dass in diesen Epithelzellen <i>E. coli</i> Pathogene innerhalb von Stunden nach Beginn der Infektion einen deutlichen Anstieg der Hp mRNA Expression verursachten, wogegen diese Expression als Antwort auf die <i>Staph. aureus</i> Infektion in den ersten 24 h unverändert blieb. Ähnliche Unterschiede zwischen den Pathogentypen ergaben sich für die Hp Konzentrationen in Blut und Milch. Beim Menschen wurde Hp mRNA in der Brustdrüse und in 50 % der untersuchten Leukozytenproben nachgewiesen. Mit dem erstmaligen Nachweis von Hp mRNA Expression in den beschriebenen Zellen konnten somit mögliche Quellen von Hp Protein in der Milch identifiziert werden.