Charakterisierung der gravitropen Signaltransduktionin <i>Helianthus annuus</i> L. über Genexpressionsanalysen nach Auxin-und Gravistimulation

Abstract

Die gravitrope Krümmungsreaktion in höheren Pflanzen als Antwort auf eine veränderte Orientierung zum gegebenen Schwerkraftvektor ist geprägt von einer asymmetrischen Verteilung des Pflanzenwuchsstoffes Auxin. Daher scheint Auxin ein wichtiges Element in der Signalweiterleitung des Schwerkraftreizes vom Ort der Schwerkraftwahrnehmung bis zum Ort der gravitropen Antwort zu sein. Auf molekularer Ebene ist die Signaltransduktion allerdings noch weitgehend ungeklärt. <br /> Ziel dieser Arbeit war es daher, die gravitrop regulierten Prozesse auf der Basis differentiell exprimierter Gene zu analysieren. In einem parallelen Versuchsansatz anhand gravistimulierter und Auxin-stimulierter Pflanzen wurde der Zusammenhang von Auxin im Gravitropismus bzw. die Abhängigkeit der gravitrop regulierten Gene von Auxin untersucht. Die Gravistimulationsexperimente erfolgten durch Kippen sieben Tage alter Sonnenblumenhypokotyle um 45°, während die Auxinstimulation durch Applikation von Indol-3-Essigsäure an Hypokotylprotoplasten vorgenommen wurde. Aufgrund der stärkeren Krümmungsreaktion sowie der höheren Auxin-abhängigen PM/H+-ATPase-Aktivität im apika-len Hypokotylabschnitt wurden die Hypokotyle in den jeweiligen Experimenten in einen apikalen und basalen Bereich unterteilt, um eine detailliertere Bestimmung des gravisensitiven Pflanzengewebes zu gewährleisten. <br /> Für die Genexpressionsanalysen wurde die Methode der Differential Display (DD)-RT-PCR herangezogen, die einen Vergleich zwischen mehreren Populationen gleichzeitig erlaubt, ohne die vorherige Kenntnis der zu untersuchenden Gensequenzen vorauszusetzen. Dabei basiert die Technik auf der Amplifikation von cDNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge mittels Zufallsprimer. Die Auftrennung der Fragmente zur Identifizierung differentieller Expressionsraten erfolgte anschließend mit einer Kapillarelektrophorese (ABI310). Nach der Gravistimulation konnten fünf Gene isoliert werden, die in ihrer Expression jeweils gravitrop hochreguliert wurden. Dazu gehörten die GTPase Ran, eine Calcium-abhängige Proteinkinase, das Histon H2B, Cytochrom c und eine Xylosyltransferase. Nach der Auxinstimulation konnten vier Gene isoliert werden, die eine herunterregulier-te Expression zeigten. Hierzu gehörten der Translations-Initiations-Faktor eIF1, eine Histondeacetylase, das Histon H3 sowie eine Fruktose-1,6-bisphosphat Aldolase. Ein Vergleich in Bezug auf die Induzierbarkeit der identifizierten Gene durch Auxin und Gravistimulation zeigte für Ran und eIF1 eine negative Korrelation und für Cytochrom c und die Xylosyltransferase eine positive Korrelation. Durch die Segmentierung der Sonnenblumenhypokotyle konnte anhand der Verteilung der differentiell exprimierten Gene sowie der Rate der Transkriptionsänderung der apikale Hypokotylbereich als das sensitivere Gewebe erkannt werden. Die Genexpression wurde neben der Gravistimulation von ganzen Hypokotylen ebenfalls in Hypokotylprotoplasten unter simulierten und realen Mikrogravitationsbedingungen untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl die Umorientierung nach Kippen der Pflanzen als auch die Bedingungen unter Mikrogravitation dieselben Reaktionen auf Transkriptionsebene in den Pflanzen hervorruft. Die positiv korrelierenden Ergebnisse nach den Gravistimulationsexperimenten in den Hypokotylen und in den Protoplasten zeigen zudem, dass Protoplasten als Modellsystem für Genexpressionsanalysen geeignet und die Ergebnisse auf intakte Pflanzen übertragbar sind.

<strong>Characterization of the gravitropic signal transduction pathway in <i>Helianthus annuus</i> L. via gene expression analysis after auxin- and gravistimulation</strong><br /> Gravity triggers a biochemical pathway, which determines the orientation of plant organs. Although signal transduction pathways following graviperception are still unclear, auxin has been proposed to be responsible for the bending reaction of the gravistimulated plant organs through its asymmetric distribution. Beside auxin as one element of the signal transduction chain linking gravi-perception to gravi-response, little is known about the molecular mechanisms involved in gravitropism. In order to gain further insight into the link between auxin and gravity the expression profiles of mRNA in etiolated sunflower (Helianthus annuus L.) seedlings were analyzed. <br /> Therefore, comparative gene expression studies with parallel auxin- and gravistimulation experiments have been established. Gravistimulation was performed by tilting of sunflower hypocotyls for different time intervals and has been supplemented by simulated (fast clinorotation) and real microgravity conditions during flight experiments (sounding rocket TEXUS40) with isolated hypocotyl protoplasts. Also auxin stimulation was achieved by application of exogenous IAA to hypocotyl protoplasts. While there is evidence for a differential sensitivity of apical and basal hypocotyl protoplasts for auxin as measured by PM/H+-ATPase activity, a separate investigation of apical and basal hypocotyl segments provided a more detailed determination of the real gravitropic sensitive tissue. <br /> Screening of mRNA profiles was done by Differential Display (DD) RT-PCR, which is one gene expression profiling technique that does not require prior knowledge of any sequences. Furthermore, DDRT-PCR supplies an approach to identify differentially expressed genes in more than one population by comparing several cell populations or variables simultaneously. Thereby the principle is based on the amplification of a numerousness of randomly primed cDNA-fragments of different lengths. Using capillary electrophoresis (ABI310) to separate the fluorophor-labeled cDNA fragments revealed the expression of genes predominantly involved in signal transduction, the regulatory machinery of translation and transcription, metabolism and cell wall. <br /> Gravistimulation identified the small GTPase Ran, a calmodulin like domain protein kinase (CDPK), histone H2B, beta-6-xylosyltransferase and electron carrier protein cytochrome c, which all were gravity inducible proteins. In contrast, the isolated genes after auxin stimulation like translation initiation factor eIF1, histone deacetylase (HDAC), histone H3 and fructose-1,6-bisphosphat aldolase (FBPA) were all suppressed by auxin. All of the auxin inducible partial gene fragments showed no apparent homology with known DNA-sequences in the gene databases. Comparing the inducibility of the identified genes by gravistimulation and auxin stimulation revealed a negative correlation for Ran and eIF1 and a positive correlation for cytochrome c and xylosyltransferase, whereas a correlation for CDPK, Histone H3 and H2B, HDAC and FBPA between gravity and auxin-induction has still to be investigated. Differing expression rates were mostly identified in apical segments, which indicate the apical segment as the more sensitive tissue concerning gravitropism and auxin. Moreover, the results obtained with protoplasts after µg-stimulation by clinorotation and TEXUS-flight and by tilting of entire hypocotyls established a positive correlation. Regarding the clearly increase of Ran-mRNA in all experiments, the comparability of protoplasts and whole plants on transcription level was shown.