Charakterisierung und Funktionsanalyse der Untereinheiten des hetero-oligomeren Oligosaccharyltransferase-Komplexes aus Schweineleber

Abstract

Die Oligosaccharyltransferase (OST), ein Schlusselenzym der N-Glykoproteinbiosynthese, katalysiert die Übertragung Dol-PP-aktivierter Oligosaccharide auf spezifische Asparaginreste wachsender Polypeptidketten. Die OST aus Schweineleber wurde als hetero-oligomerer Komplex gereinigt, der OST48, Ribophorin I, Ribophorin II und ein weiteres 40 kDa Protein enthielt. Daneben scheinen DAD1 und STT3 weitere Untereinheiten des OST-Komplexes darzustellen. Die spezifischen Funktionen der Untereinheiten sowie die tatsächliche Zusammensetzung des Enzym-Komplexes sind in wesentlichen Punkten noch unverstanden. <br /> Mit dem Ziel, Aminosäuren im aktiven Zentrum der OST zu identifizieren, wurden in der vorliegenden Arbeit Messungen mit verschiedenen Inhibitoren durchgeführt. Die Ergebnisse der Hemm-Messungen mit TLCK, einem Reagenz, das mit Histidinseitenketten im aktiven Zentrum von Enzymen reagieren kann, sprechen für das Vorhandensein eines Histidinrestes am aktiven Zentrum der OST und für dessen Beteiligung an der Katalyse. Untersuchungen mit einem Hexapeptid, in das zwei 5-Azido-2-nitrobenzoylgruppen eingeführt worden waren, zeigten, dass dieses Peptid ein gutes Substrat der OST darstellt und die OST in einer zeitabhängigen Reaktion zu hemmen vermag, die Hemmung war jedoch insgesamt nur mässig. Um spezifische Funktionen der Untereinheiten im OST-Komplex zu untersuchen, wurde die cDNA von DAD1 kloniert. Aktivitätsmessungen mit den verschiedenen Untereinheiten (OST48, Ribophorin I, Ribophorin II und DAD1), die in COS 1-Zellen überexprimiert worden waren, zeigten, dass die Untereinheiten für sich alleine als katalytisch inaktive Proteine synthetisiert werden, wohingegen die Koexpression von OST48 und Ribophorin I zu einem reproduzierbaren Aktivitätsanstieg von ca. 80 % -bezogen auf Kontrollzellen- führte. Dies lässt vermuten, daß OST48 und Ribophorin I direkt an der Katalyse beteiligt sind. Aktivitätsmessungen mit OST48 und Ribophorin I, die unter zellfreien Bedingungen in einem gekoppelten Transkriptions-/Translationssystem synthetisiert worden waren, haben gezeigt, daß die Synthese beider Untereinheiten zusammen auch hier zu einer zwar mässigen (~25 %igen) aber reproduzierbaren Erhoehung der OST-Aktivität fuehrte.

<b>Characterisation and functional analysis of subunits of the hetero-oligomeric oligosaccharyltransferase-complex of pig liver</b><br /> The oligosaccharyltransferase (OST) a key enzyme of the N-linked biosynthesis, catalyses the transfer of Dol-PP-activated oligosaccharides to selected asparagine side chains of nascent polypeptides. OST from pig liver was purified as a hetero-oligomeric complex composed of four subunits (OST48, Ribophorin I, Ribophorin II and a 40 kDa protein). DAD1 and STT3 seem to be further subunits of the mammalian OST-complex. The specific functions of the different subunits and the structure of the enzyme remain unknown at present. <br /> In order to identify amino acids in the active site of the complex OST activity was measured in the presence of different inhibitors. Studies with N-tosyl-L-lysine-chlormethylketone (TLCK), a reagent that reacts with histidine side chains at the active site of enzymes, indicate that histidine is located at the active site and is involved in catalysis. Investigations with a hexapeptide containing two photoactivatable azido groups led to an inactivation of the OST in a time-dependent manner, which was however moderate. In order to investigate specific functions of the different subunits the cDNA of DAD1 was cloned. Expression studies with the different subunits (OST48, Ribophorin I, Ribophorin II, DAD1) showed that the single subunits when over expressed in COS 1-cells were without catalytic activity. Co-expression of OST48 and Ribophorin I resulted in a reproducible increase (~80%) in OST activity, suggesting that OST48/Ribophorin I are directly involved in catalysis. Investigations with OST48 and Ribophorin I, which were expressed in vitro in a coupled transcription-/translation system, have shown that the co-expression of both proteins results in a modest (~25 %) but reproducible increase in OST activity.