Dissecting rhizobacteria-induced systemic resistance in tomato against <em>Meloidogyne incognita</em>

Abstract

Two rhizobacteria with known ability to induce systemic resistance against different soilborne pathogens were studied in split-root experiments for their ability to induce systemic resistance against the root-knot nematode <i>Meloidogyne incognita</i> in tomato. In tomato plants treated with the bacteria strains, <i>Rhizobium etli</i> G12 or <i>Bacillus sphaericus</i> B43, penetrated significantly less juveniles and also reduced the multiplication of the penetrated females after treatment with G12. Results of split-root experiments showed that the penetration of the nematodes was reduced in the responder root, which was the non-bacterial inoculated root, thus confirmed the occurrence of induced systemic resistance (ISR). The bacterial treatment did not affect the root development of tomato plants.<br /> The observed induced systemic resistance was further characterized at the molecular level by subtractive suppressive hybridization using RNA of bacteria treated, bacteria and nematode treated, and untreated tomato plants. The goal was to isolate and characterize plant genes, which were differentially expressed following rhizobacteria-induced systemic resistance.<br /> To obtain only plant RNA without bacteria or nematode RNA contamination a specific split-root set-up was designed. The bacteria as well as the nematodes were applied to the inducer root of the tomato plants and the RNA was extracted from the responder root, which was the non-inoculated root. That ISR was present in the responder root of this set-up was verified by a biocontrol assay, in which nematodes were inoculated at the responder root in a parallel inoculation experiment.<br /> The subtractive suppressive hybridization resulted in the isolation and characterization of 24 potential differentially expressed genes of the induced plants. To confirm the differential expression, different molecular biological analysis methods were used. Northern blotting combined with chemiluminescent or radioactive detection, were not sensitive enough to detect the very small differences in the transcription profile of induced and non-induced tomato plants. The semiquantitative reverse transcriptase PCR showed that the two different bacteria strains induced different reactions in tomato plants. After a G12 treatment the gene coding for the polygalacturonase isoenzyme 1 beta subunit was down-regulated. A B43 treatment or a combined B43 and nematode application up-regulated the gene coding for the phenylalanine ammonia-lyase enzyme (PAL5). These findings exemplify the complexity of rhizobacteria-induced systemic resistance against <i>Meloidogyne incognita</i>.

<strong>Analyse der Rhizosphärebakterien-induzierten systemischen Resistenz in Tomate gegen <i>Meloidogyne incognita</i> - Der erste Schritt molekulare Methoden zu nutzen</strong><br /> Zwei Rhizosph ärebakterien mit der bereits bekannten Fähigkeit, systemisch Resistenz gegen verschiedene bodenbürtige Krankheitserreger induzieren zu können, wurden in 'split-root' Experimenten auf ihre Fähigkeit untersucht, systemisch Resistenz gegen den Wurzelgallennematoden in Tomaten zu induzieren. In mit den Bakterien, <i>Rhizobium etli</i> G12 oder <i>Bacillus sphaericus</i> B43, behandelten Tomaten drangen signifikant weniger Nematodenlarven ein und die Vermehrung der eingedrungenen Weibchen nach einer G12 Behandlung war ebenso reduziert. Die Ergebnisse der 'split-root' Experimente zeigten, dass die Eindringung der Nematoden in der 'Responder-Wurzel', also der Wurzel, die nicht mit Bakterien behandelt wurden, verringert war. Das bestätigte eine systemische Resistenzinduktion. Das Wurzelwachstum der Tomaten wurde durch Bakterienbehandlungen nicht beeinflusst.<br /> Diese induzierte systemische Resistenz wurde auf molekularer Ebene mit Hilfe von subtraktiver suppressiver Hybridisierung anhand der RNS Bakterien behandelter, Bakterien und Nematoden behandelter und unbehandelter Tomaten weiter charakterisiert. Ziel war es, Pflanzengene zu isolieren und charakterisieren, die nach einer Rhizosphärebakterien-induzierten systemischen Resistenz differentiell exprimiert waren.<br /> Um nur pflanzliche RNS, ohne Verunreinigungen durch Bakterien- oder Nematoden-RNS zu erhalten, wurde ein spezieller 'split-root' Aufbau gewählt. Dabei wurden sowohl die Bakterien als auch die Nematoden auf die 'Induzierer-Wurzel' der Tomaten appliziert und anschließend die pflanzliche RNS aus der 'Responder-Wurzel' extrahiert. Das Auftreten von induzierter systemischer Resistenz in den 'Responder-Wurzeln' dieses 'split-root' Aufbaus konnte anhand einer Kontrolluntersuchung, in der Nematoden auf die 'Responder-Wurzeln in einem parallel inokulierten Experiment appliziert wurden, bestätigt werden.<br /> Eine subtraktive suppressive Hybridisierung brachte 24 potentiell differentiell exprimierte Gene aus induzierten Pflanzen hervor. Um diese potentiell differentiellen Gene zu bestätigen, wurden verschiedene molekularbiologische Methoden genutzt. Northern Blotting mit chemiluminesent oder radioaktivem Nachweis waren nicht sensitiv genug, um die sehr geringen Unterschiede im Transkriptenprofil einer induzierten und nicht-induzierten Tomatenpflanze festzustellen. Die semiquantitative reverse-Transkriptase PCR zeigte, dass die beiden unterschiedlichen Bakterienstämme verschiedene Reaktionen in den Tomatenpflanzen verursachen. Nach einer G12 Behandlung war das Gen, das für die beta-Untereinheit des Polygalakturonase Isoenzyms 1 kodiert, herunterreguliert. Sowohl eine alleinige B43 Behandlung als auch einer kombinierte Applikation von B43 und Nematoden regulierten das Gen, welches das Enzym Phenylalaninammoniumlyase (PAL5) kodiert, herauf. Diese Forschungsergebnisse veranschaulichen die Komplexität der Rhizosphärebakterien-induzierten systemischen Resistenz gegen <i>Meloidogyne incognita</i>.