Untersuchungen mit dem Ecdyson-induzierbaren Promotorsystem an humanen Tumorzelllinien

Abstract

Induzierbare Genexpressionssysteme ermöglichen die Untersuchung von Genfunktionen in Zellen, besonders der dortigen Wirkung toxischer und teratogener Proteine, sowie der regulierten Expression von antisense Sequenzen oder siRNA Sequenzen zur Regulation endogener Genexpression. Durch die präzise Kontrolle der Genexpression können biochemische und physiologische Prozesse reversibel analysiert werden.<br /> Das von Drosophila melanogaster stammende endogene Ecdyson-induzierbare Genexpressionssystem, dessen Effizienz bereits in CHO-Zellen (Chinese hamster ovary) gezeigt worden war, sollte auf humane Tumorzelllinien [HCT116 (humanen Colon Carzinom Zellen), Hela (humane Cervix Carzinom Zellen) und HaCat (humanen Keratinozyten Zellen)] Anwendung finden, um nachfolgend Untersuchungen mit antisense oder siRNA Vektoren zum Studium der Genfunktion zu ermöglichen.<br /> Mittels Lipofektion bzw. Elektroporation wurde das Ecdyson-induzierbare Rezeptorsystem (pVgRxR) in die Zellen integriert und mit Hilfe der Northern Blot Analyse seine Expression nachgewiesen. Ebenso wurde ein alternativer Reportervektor (pEF-EIR) lipofiziert, bei dem beide Reportergene von einer bizistronischen mRNA exprimiert werden. Zur Identifizierung induzierbarer Zelllinien sollte das Reporterprotein GFP (grün fluoreszierendes Protein) dienen, das mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, der Western Blot Analyse wie auch der Immunhistochemie nachgewiesen wurde.<br /> Von den drei verwendeten Zelllinien war lediglich bei der HCT116 Zelllinie ein funktionierendes Rezeptorsystem nachweisbar. Allerdings funktionierte das induzierbare Promotorsystem nur in einem Teil der Zellen eines Klons. Als Ergebnis der Arbeit wurde ein Klon von HCT 116 Zellen isoliert, bei dem das Ecdyson-induzierbare Genexpressionssystem mit den genannten Einschränkungen angewendet werden kann.