Entwicklung eines Zellkulturmodells zur metachromatischen Leukodystrophie durch Transduktion glialer Zellen mit lentiviralen Vektoren

Abstract

Die metachromatische Leukodystrophie ist eine autosomal-rezessiv vererbte, lysosomale Speicherkrankheit mit schwerwiegendem Verlust erlernter Fähigkeiten und infauster Prognose. Die Erkrankung ist unaufhaltsam progredient, die Patienten versterben im Stadium der Dezerebration. Ihr liegt zumeist eine Defizienz der Arylsulfatase A zugrunde, welche ein Schlüsselenzym im Abbau der 3,0-Sulfogalactosyl-Glykolipide, insbesondere des Sulfatids, ist. Konsekutiv wird Sulfatid gespeichert, vor allem im zentralen und peripheren Nervensystem, aber auch in Niere, Gallenblase und den Gallengangsepithelien der Leber. Die Speicherung führt zur einer weitreichenden zentralen und peripheren Demyelinisierung und dem Untergang glialer und neuronaler Zellen und somit zum Krankheitsbild der metachromatischen Leukodystrophie. Der pathogenetische Zusammenhang zwischen Sulfatid-Speicherung, Demyelinisierung und dem Zellverlust ist nach wie vor ungeklärt. Ein Tiermodell zur Untersuchung der metachromatischen Leukodystrophie steht mit einer ASA-Knockout-Maus zur Verfügung, ein etabliertes Zellmodell für die metachromatische Leukodystrophie gab es bislang nicht. <br /> In dieser Arbeit wurde ein in vitro-Modell zur Untersuchung der Pathogenese der metachromatischen Leukodystrophie entwickelt. Zunächst wurden lentivirale Vektoren mittels Calcium-Phosphat-Transfektion von HEK293T-Zellen hergestellt, die für die cDNAs der Cerebrosidsulfotransferase und der Ceramidgalaktosyltransferase kodierten. Diese beiden Enzyme sind für die Sulfatid-Biosynthese notwendig. Die Funktionstüchtigkeit der Vektoren sowie der übertragenen Enzyme wurde durch Transduktion von CHO-Zellen und Lipidanalyse mittels Dünnschichtchromatographie und Immundetektion bewiesen. ASA-defiziente Oligodendrozyten aus dem zentralen Nervensystem erwiesen sich durch aufwendige Präparation und niedrige Transduktionseffizienz als unbrauchbar für die biochemische Analyse. ASA-defiziente Schwann-Zellen aus dem peripheren Nervensystem wurden kombiniert mit den lentiviralen Vektoren für die cDNA der CST und die cDNA der CGT transduziert. Eine vermehrte Sulfatid-Speicherung im Vergleich zu untransduzierten Zellen konnte durch Immundetektion von Sulfatid nachgewiesen werden.