Bovine microRNomics: Implications during oocyte maturation and pathophysiology of endometrium

Abstract

MicroRNAs which are known for posttranscriptional gene regulation are evidenced for their essential role during animal development and disease. In this study, identification and expression profiling of bovine miRNAs during oocyte maturation are scrutinized using heterologous approach, while miRNA regulated novel molecular signature underlying bovine subclinical endometritis was dissected using an integrative approach. Primarily, identification and expression profiling of microRNAs during bovine oocyte maturation was investigated using miRCURY^TM locked nucleic acids (LNA) array (Exiqon, Vedbaek, Denmark) microarray that consist of 454 capture probes for human, mouse and rat miRNAs. The result revealed differential expression of 59 miRNAs, of which 31 and 28 miRNAs were found to be preferentially expressed in immature and matured oocytes, respectively. Here, 32 new bovine orthologous miRNAs were identified using a heterologous approach. Furthermore, the preliminary attempt to dissect the specific function of miR-99a and miR-100 in invitro cumulus cell showed that both miRNAs down regulate bovine tribbles homologue 2 (TRB2). On the other hand, genome wide RT² miRNA PCR array consisting of 354 well characterized human miRNA primers was used to analyze miRNA expression in the uterine cytobrush samples taken from cows with subclinical endometritis and healthy. The result showed the aberrant expression of 23 miRNAs in cows with subclinical endometritis as compared to the healthy ones. Interestingly, the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for high ranking target genes of aberrantly expressed miRNAs identified gene networks, canonical pathways and biological functions that converged to array of signaling pathways and cellular activities inherent to the endometrium during estrous cycle and pregnancy. Furthermore, the luciferase assay data substantiated the primary information from bioinformatic prediction and enabled us to deduce a convincing link between the aberrantly expressed miRNAs and target genes. Taken together, identification and dynamic expression pattern of certain class of miRNAs during bovine oocyte maturation suggests their potential involvement in early embryo development; where as, aberrant expression of uterine miRNAs in animals with subclinical endometritis potentially interfere with the tight uterine gene regulation.

<strong>Bovines microRNomics: Bedeutung während der Eizellreifung und die Pathophysiologie des Endometriums</strong><br /> MikroRNAs (miRNAs), die bereits für die Regulierung von posttranskriptionalen Genen bekannt sind, konnte eine essentielle Rolle für die Entwicklung von Tieren und Krankheiten nachgewiesen werden. In dieser Studie wurden bovine miRNAs während der Eizellenreifung identifiziert und mittels verschiedener Methoden das Expressionsprofil untersucht. miRNAs, die eine neuartigen molekulare Signatur auf Grundlage einer subklinischen Endometritis zeigten wurden mit Hilfe eines integrativen Untersuchungsansatzes erforscht. Zuerst wurde die Identifikation und die Erstellung von Expressionsprofilen von miRNAs während der bovinen Eizellenreifung mittels des „miRCURY^TM locked nucleic acids (LNA) array“ (Exiqon, Vedbeak, Denmark) durchgeführt. Dieser Microarray besteht aus 454 bekannten Sonden von Mensch, Maus und Ratten miRNAs. Die Ergebnisse zeigten 59 unterschiedlich exprimierte miRNAs, von denen 31 hauptsächlich in unreifen und 28 in reifen Eizellen überexprimiert wurden. Hierbei wurden mit verschiedenen Ansätzen 32 neue orthologe bovine miRNAs identifiziert. Des Weiteren wurden erste Versuche durchgeführt, um die spezifischen Funktionen von miR-99a und miR-100 innerhalb eines „in-vitro“ Kumuluszellen Modells zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass miR-99a und miR-100 die Expression des bovinen tribbles homologue 2 Gens (TRB2) runter regulieren. Zum Anderen wurde mittels eines genomweitem RT² miRNA PCR Arrays, bestehend aus 354 gut beschriebenen humanen miRNA Primern, an uterinen Cytobrush-Proben von Kühen die entweder an subklinischer Endometritis erkrankt oder gesund waren, Expressionsanalysen durchgeführt. Das Ergebnis dieses Versuches zeigte abweichende Expressionen von 23 miRNAs in Geweben von Kühen mit subklinischer Endometritis im Vergleich zu den gesunden Tieren. Interessanterweise konvergieren die mittels der Igenuity Pathway Analyse(IPA), identifizierten Gennetzwerke, bekannten Pathways sowie biologische Funktionen mit den Signalwegen und zellulären Aktivitäten innerhalb des Endometriums während des Östruszyklus und der Trächtigkeit. Des Weiteren bestätigte der Luziferase Assay die vorangegangenen Informationen der bioinformatischen Auswertung und ermöglichte uns einen schlüssigen Zusammenhang zwischen der veränderten miRNA Expression und den Zielgenen abzuleiten. Zusammengefasst, zeigt die Identifikation sowie das dynamischen Expressionsmuster der bestimmten Klasse von miRNAs während der bovinen Eizellreifung ihren potentiellen Einfluss auf die frühe Embryonalentwicklung; wohingegen die unterschiedliche Expression der uterinen miRNAs bei Tieren mit subklinischer Endometritis möglicherweise die uterine Genregulation beeinträchtigt.