Mapping of quantitative trait loci for immune response traits and expression patterns of Toll-like receptors in lymphoid tissues in pigs

Abstract

The aim of this research was to identify the quantitative trait loci (QTL) affecting antibody and innate immune response traits. For this purpose, Duroc-Pietrain (DUPI) pigs (n = 319) were genotyped with 122 genetic markers and phenotypes of serum antibodies for Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) and tetanus toxoid (TT), and interferon-gamma (IFNg) levels were measured following vaccinations (Mh, TT, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus [PRRSV]). Line-cross and imprinting QTL analysis were performed using QTL Express. A total of 30 QTL (12, 6, and 12 QTL for Mh, TT antibody, and IFNg, respectively) were identified, of which 28 QTL were detected by line-cross and 2 QTL by imprinting model. The serum concentration of interleukin 2 (IL2), IL10, IFNg, Toll-like receptor (TLR2) and TLR9 were measured in another group of DUPI population (n = 334) following vaccinations that were genotyped with 82 genetic markers. A total of 33 single QTL were detected, of which eight, twelve and thirteen QTL were identified for immune traits in response to Mh, TT and PRRSV vaccine, respectively. All immune traits are influenced by multiple chromosomal regions implying multiple gene action. Furthermore, expression stability of nine commonly used housekeeping genes (HKG) was studied using qRT-PCR in most lymphoid tissues at different ages (newborn, young and adult) of pigs. This study found that HKG becomes heterogeneous with age and the geometric mean of the RPL4, PPIA and YWHAZ seem to be the most appropriate combination of HKG for accurate normalization of gene expression data in pigs. Moreover, the expression patterns of ten TLRs (1-10) were studied in the same tissues used for HKG study. This study revealed that TLRs mRNA expressions were affected by age and organs. Most of the TLRs expression was higher at young pigs compared to adult and newborn pigs. TLR3 gene was the highest abundant among all TLRs in most tissues. The western blot results of TLR2, 3 and 9 in selected tissues appeared to be consistent with the mRNA expression. The protein localization showed that TLRs expressing cells were abundant in lamina propria, Peyer’s patches in intestine, around and within the lymphoid follicles in the mesenteric and cervical lymph node, within the white pulp in spleen and on the lining cells in bronchioles in lungs. This expressions study first shed light on the expression patterns of all TLR genes in important lymphoid tissues including gut-associated lymphoid tissues in different ages of pigs.

<strong>QTL-Kartierung von Immunreaktionsmerkmalen und Expressionsmuster des Toll-like Rezeptors in lymphatischen Gewebe beim Schwein</strong><br /> Das Ziel dieser Studie war Quantitative Trait Loci (QTL), die Einfluss auf Antikörper und Merkmale der angeborenen Immunreaktion haben, zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Duroc×Pietrain Schweine (DUPI) (n = 319) mittels 122 genetischen Markern genotypisiert. Die Phänotypen der Antikörperspiegel von Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), Tetanus Toxoid (TT) sowie von Interferon-gamma (IFNg) wurden nach der Impfung (Mh, TT, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus [PRRSV]) im Serum gemessen. Die QTL-Analysen wurden mit Hilfe der Software QTL-Express ausgeführt. Insgesamt wurden 30 QTL (jeweils 12, 6 und 12 QTL für Mh, TT-Antikörper und IFNg) identifiziert, wobei bei 2 QTL der Einfluss von Imprintingeffekten nachgewiesen wurde. In einer weiteren Gruppe der DUPI-Population (n = 334), welche mittels 82 Markern genetisch erfasst wurden, wurden die Serumkonzentrationen des Interleukins 2 (IL2), IL10, IFNg, Toll-like Rezeptor 2 (TLR2) und TLR9 nach der Impfung gemessen. Dabei wurden insgesamt 33 QTL detektiert, von denen jeweils 8, 12 und 13 QTL mit der Immunreaktion auf Mh, TT und PRRSV Impfungen assoziierten. Alle Immunmerkmale wurden durch mehrere chromosomale Regionen beeinflusst, was multiple Genaktionen impliziert. Darüber hinaus wurde die Expressionsstabilität von 9 häufig verwendeten ‚house keeping’ Genes (HKG) mit Hilfe der qRT-PCR inngerhalb von lymphatischen Geweben von Tieren unterschiedlichen Alters (Neugeborene, Jungtiere, Adulte) untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Expression der HKG mit dem Alter heterogen werden. Somit scheint das geometrische Mittel von RPL4, PPIA und YWHAZ am geeignetsten für die Normalisierung von Genexpressionsdaten beim Schwein zu sein. Dasselbe Gewebe der Referenzgenanalyse wurde für die Expressionsanalyse von zehn TLRs (1-10) verwendet. Diese Analyse zeigte, dass die TLRs mRNA-Expression vom Alter und Organen abhängig war. Dabei konnte eine höhere TLRs Expression bei Jungtieren und eine geringere bei Adulten und Neugeborenen detektiert werden. Das Gen TLR3 hatte das höchste Expressionsniveau in der Mehrzahl an Geweben von allen TRL Genen. Die Ergebnisse des Western Blot von TLR2, 3 und 9 in ausgewählten Geweben stimmten mit den Genexpressions-Analysen überein. Die Protein-Lokalisierung zeigte, dass TLRs in Zellen von lamina propria, Peyer’s Drüsen im Darm, in und um die lymphoiden Folikel des mesenterial und zervikalen Lymphknotens, im weißen Zellengwebe der Milz und in den Bronchialepithelien der Lunge exprimiert werden. Diese Expressionsstudie lieferte die ersten Erkenntnisse über die Expressionsmuster aller TLR in Lymphgeweben einschließlich der Lymphgewebe des Darms bei verschiedenen Alterstufen beim Schwein.