Analyse der Ligandenbindungsstelle des menschlichen P2Y₁₂-Rezeptors mittels Mutagenese

Abstract

Der P2Y₁₂-Rezeptor spielt eine wichtige Rolle bei der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation. Der aktive Metabolit von Clopidogrel ist ein irreversibler Antagonist am P2Y₁₂-Rezeptor. Disulfidbrücken scheinen für die Wirkung von Thienopyridinen wie Clopidogrel wichtig zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurde die molekulare Struktur des Rezeptors mittels zielgerichteter Mutagenese untersucht. Es wurden hierfür Arginin 256 in Transmembranstruktur 6, Lysin 280 in Transmembranstruktur 7 sowie die vier extrazellulären Cysteine an den Positionen 17,97, 175 und 270 durch Anwendung mutagener Primer gegen Alanin ausgetauscht. Anschließend erfolgte die Expressionsanalyse mittels direkter Immunocytochemie mit einem monoklonalen, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörper. Hier konnte gezeigt werden, dass alle Konstrukte in die Zellmembran von CHO-Zellen exprimiert werden. Im Anschluss daran erfolgte die funktionelle Testung durch Messung der ADP-induzierten Hemmung der zellulären cAMP-Bildung. An Zellen mit dem Rezeptorkonstrukt Arginin256Alanin wurde eine Wirkungsabschwächung von ADP, an Zellen mit dem Konstrukt Lysin280Alanin ein kompletter Wirkverlust von ADP beobachtet. An Zellen mit dem Konstrukt Cystein97Alanin kam es einer Abschwächung der Antwort auf die Rezeptoraktivierung. Die Ergebnisse ermöglichen die Entwicklung eines Rezeptormodells auf dessen Grundlage eine rationale Arzneistoffentwicklung betrieben werden kann.