Einfluss der Plasmamatrix auf das pharmakodynamische Wirkprofil von aktiviertem Protein C -Aptameren

Abstract

Das Protein-C-System reguliert die Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems durch proteolytische Inaktivierung der aktivierten Gerinnungsfaktoren V und VIII. Das als Zymogen im Blut zirkulierende Protein C, als Schlüsselenzym des Systems, wird an der Oberfläche von Endothelzellen durch einen proteolytischen Komplex bestehend aus Thrombin und Thrombomodulin aktiviert. Durch diesen Prozess kann die Blutgerinnung auf defekte Gefäßwandbereiche beschränkt werden. Desweiteren besitzt aktiviertes Protein C (APC) antiapoptotische und entzündungshemmende Eigenschaften, weshalb eine rekombinant hergestellte Form des APCs (XIGRIS®) als Medikament in der Behandlung der schweren Sepsis eingesetzt wird.<br /> Blutungskomplikationen stellen eine relevante Nebenwirkung der APC-Therapie dar, die aufgrund des Fehlens eines APC-Antidots bisher nur durch allgemeine hämostyptische Maßnahmen behandelt werden können. Ein mögliches APC-Antidot stellen APC-spezifische DNA-Aptamere dar.<br /> In dieser Arbeit sollte die Affinität zu APC von fünf Aptameren in einer Länge zwischen 44 und 88 Nukleotiden der Aptamergruppe HS02 quantifiziert und verglichen werden. Die Stabilität der verschieden langen Aptamere sollte in humanem Plasma und Vollblut überprüft werden. Weiterhin sollte in verschiedenen in-vitro-Untersuchungen getestet werden, ob die APC-inhibitorische Wirkung der HS02-Aptamere zur Antagonisation von rekombinantem APC bei möglichen Blutungskomplikationen eingesetzt werden kann und ob die Aptamer-vermittelte Hemmung der APC-Wirkung einen möglichen supportiven Ansatz in der Behandlung von Patienten mit Hämophilie A und B darstellt.<br /> In Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Aptamere APC in humanem Plasma und in Vollblut mit hoher Effektivität im niedrigen nanomolaren Bereich inhibieren. Es stellte sich heraus, dass die Affinitäten der einzelnen Aptamere gegenüber dem Zielmolekül in den getesteten Plasmen differierten. In Ca²⁺-haltigem Plasma wiesen die Aptamere HS02-48G und HS02-52G die höchste Affinität auf. Die Affinität des Aptamers HS02-88 war dagegen eingeschränkt. Im weiteren Versuchsablauf zeigte sich, dass das kürzeste Aptamer, das auf das Minimalmotiv HS02-44G beschränkt war, am instabilsten war und initial in Ca²⁺-haltigem Plasma deutlich an inhibitorischer Wirkung verlor. Im Gegensatz hierzu stellten sich vor allem die Aptamere HS02-52G und HS02-48G als die stabilsten Aptamere der Gruppe HS02 heraus und blieben auch über einen Inkubationszeitraum von 6 Stunden weitestgehend stabil.<br /> Über die generierten Oligonukleotide ist es im in-vitro-System möglich die antikoagulatorische Wirkung von rAPC effektiv aufzuheben. Dies legt eine Verwendung der HS02-Aptamere als rAPC-Antidot nahe.<br /> Auch in der Behandlung von Hämophilie-A-Patienten könnte der Einsatz von HS02-Aptameren hilfreich sein, da endogen gebildetes APC inaktiviert wird und somit die geringe Restkonzentration von funktionell aktivem FVIII vor proteolytischer Inaktivierung geschützt wird. Diese Hypothese konnte in APC-Generierungsexperimenten mit FVIII-Mangelplasma belegt werden. Allerdings muss in der Nutzen-Risiko-Abwägung eines solchen Therapieansatzes das prothrombotische Potenzial einer APC-inhibierenden Therapie berücksichtigt werden.