Expression analysis of regulatory MicroRNA in bovine cumulus oocyte complex and preimplantation embryos

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are small non coding endogenous molecules which participate in gene regulation post transcriptionally. These small RNAs are shown to be involved in a wide range of biological processes including development, cell differentiation, cell proliferation and apoptosis in diverse organisms. However, little is known about their abundance in bovine oocytes and their surrounding cumulus cells during oocyte development. To elucidate this, we investigated the relative expression pattern of a set of 88 miRNAs between bovine oocytes and the surrounding cumulus cells during <em>in vitro</em> maturation, using miRNA PCR array related to human cell development and differentiation. Results revealed a total of 47 and 51 miRNAs to be differentially expressed (p ≤ 0.05 and fold change ≥ 2) between immature (GV) and matured (MII) oocytes, respectively compared to their surrounding cumulus cells. However, 8 and 6 miRNAs were found to be highly abundant in cumulus cells compared to oocytes at immature and matured stages, respectively. The expression analysis of six oocytes enriched miRNAs (miR-205, -150, -122, -96, -146a and -146b-5p) in bovine preimplantation embryo stages was performed. Results showed that expression of these miRNAs were highly abundant in early stages of embryo development and reduced after 8-cell until the blastocyst stage following a typical maternal transcript profile. Comparable results were obtained by <em>in situ</em> localization of miR-205 in preimplantation embryo stages. However, the two selected miRNAs enriched in cumulus cells (miR-210 and miR-452) showed no defined profile. The same eight miRNAs were detected at high level in fully grown oocyte (BCB+) compared to growing one (BCB-). Interestingly, the presence or absence of oocytes or cumulus cells during maturation was found to affect the expression of selected miRNAs in each of the two cell types. Furthermore, miR-205 and miR-210 were <em>in situ</em> localized in ovarian follicle and revealed a spatio-temporal expression during follicular development. Hence, our results evidenced the presence of distinct set of miRNAs in oocytes and cumulus cells which may have potential role in regulation of bidirectional communication between the two cell types. Moreover, maternal miRNAs were found to persist until the major genome activation in bovine.

<strong>Expressionsanalyse von regulierenden MircoRNA im bovinen Kumulus-Oocyten Komplex und präimplantierten Embryonen</strong><br /> MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende endogene Moleküle, die an der post-trankriptionellen Genregulierung beteiligt sind. Diese kleinen RNAs sind an einer Reihe von biologischen Prozessen, wie Entwicklung, Zelldifferenzierung, Zellproliferation und Apoptose in verschiedenen Organismen, involviert. Jedoch ist bisher nur wenig über ihre Rolle in bovinen zellen und umgebenden Kumuluszellen während der Eizellenentwicklung bekannt. Um dieses aufzuklären, untersuchten wir die relativen Expressionsmuster zwischen bovinen Eizellen und den umgebenden Kumuluszellen während der<em> in vitro</em> Maturation. Die Expressionsmuster eines Sets von 88 miRNAs wurden mittels eines miRNA PCR Arrays für humane Zellentwicklung und-differenzierung erfasst. Die Ergebnisse zeigten, dass insgesamt 47 bzw. 51 miRNAs unterschiedlich zwischen immaturen (GV) bzw. reifen Eizellen (MII) und ihren umgebenden Kumuluszellen exprimiert waren (p ≤ 0.05, fold change ≥2). Dabei wurden 8 bzw. 6 miRNAs stärker in den Kumuluszellen exprimiert beim Vergleich von Eizellen im reifen bzw. unreifen Stadium. Weitere Expressionsanalysen wurden von sechs ausgewählten miRNAs (miR-205, -150, -122, -96, -146a und 146b-5p) in bovinen Embryonen des Präimplantationsstadiums durchgeführt, da diese in Eizellen angereichert auftraten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression dieser miRNAs stark erhöht in frühen Stadien der Embryonalentwicklung und reduziert nach dem 8- Zellen-Stadium. Zu beobachten waren bis zum Blastozysten Stadium folgten die Embryonen den typischen maternalen Transkriptionsmustern. Vergleichbare Ergebnisse wurden bei der <em>in situ</em> Lokalisierung von miR-205 in Embryonen des Präimplantationsstadiums beobachtet. Leider zeigten die ausgewählten miRNAs (miR- 210 und miR-452), die in Kumuluszellen vermehrt exprimiert waren, kein definiertes Profil. Die gleichen acht miRNAs wurden in einer hohen Menge in voll ausgewachsenen Eizellen (BCB+) im Vergleich zu noch wachsenden Eizellen (BCB-) detektiert. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass die Präsenz oder Abwesenheit von Eizelle oder Kumuluszellen während der Maturation einen Einfluss auf die Expression der ausgewählten miRNAs in den entsprechenden Zelltypen hatte. Des Weiteren wurden miR-205 und miR-210 <em>in situ</em> in Follikeln lokalisiert und zeigten eine raum-zeitliche Expression während der Follikelentwicklung. Unsere Ergebnisse zeigen die Präsenz einer definierten Gruppe von miRNAs in Eizellen und Kumuluszellen, welch möglicherweise eine Rolle in der Regulation der bidirektionellen Kommunikation zwischen diesen zwei Zelltypen spielen.