Epigenetic and molecular mechanisms underlying gene expression in porcine skeletal muscle and satellite cells

Abstract

Epigenetic studies have been conducted in association with skeletal muscle only during the last years. We performed <em>in vivo</em> study in skeletal muscle and <em>in vitro</em> study in satellite cells with the aims to understand the epigenetic mechanisms regulating muscle gene expression. Duroc and Pietrain pigs, representing two extremes in skeletal muscle phenotypes, were selected for the in vivo study. Myogenic factor 6 (MYF6) was selected as one of the contributing factors to the postnatal breed-specific muscle properties in two breed pigs. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) and Western blotting results revealed that mRNA and protein expression of MYF6 were dramatically higher in Pietrain pigs compared to Duroc pigs and suggested breed-specific expression. Variations in DNA methylation of the MYF6 gene 5´-regulatory region, particularly within important transcription factor binding elements, are shown to occur between breeds. However, in Pietrains pigs, higher expression of MYF6 is not consistent with hypermethylation status, but concurrent with enriched E2F1 expression. In addition to its practical implications, this work extends our understanding the role of epigenetic mechanism in postnatal pigs. Satellite cells, acting as the muscle stem cells to support postnatal muscle growth, were selected for the <em>in vitro</em> study. Sulforaphane (SFN), a novel and natural histone deacetylase (HDAC) inhibitor, was selected as the treatment epigenetic reagent. Apart from SFN, we also employed the typical epigenetic reagents 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC) and trichostatin (TSA). Distinguished from TSA, SFN and 5-aza-dC remarkably suppress myostatin (MSTN) expression and inhibit HDAC activity as well as DNA methyltransferase (DNMT) expression. SFN, 5-aza-dC and TSA exhibited differential mechanisms to repress MSTN expression and negative regulators of MSTN pathway. Deregulated miRNA may be excluded from epigenetic repression of MSTN. However, epigenetic suppression of MSTN by 5-aza-dC and SFN is associated with the decreased myoblast determination protein (MyoD) expression, reduced binding of MyoD on MSTN promoter and hypoacetylation in MyoD binding site. These observations manifest a novel mechanism for manipulation of muscle cell phenotypes.

<strong>Epigenetische und molekulare Mechanismen die der Genexpression in porcinen Skelettmuskel und Satellitenzellen zugrunde liegen</strong><br /> den letzten Jahren wurden epigenetische Studien nur in Zusammenhang mit der Skelettmuskulatur umgesetzt. Wir hingegen führten <em>in vivo</em> Studien an der Skelettmuskulatur und <em>in vitro</em> Studien in Satellitenzellen durch, mit dem Ziel ein besseres Verständnis der epigenetischen Mechanismen zu erlangen, die einen Effekt auf die Regulierung von relevanten Muskelgenen haben könnten. Für die in vitro Studie wurden Duroc und Pietrain Schweine, die sich in ihrem Phänotyp der Skelettmuskulatur stark unterscheiden, ausgesucht. Myogener Faktor 6 (Myf6) gilt als ein entscheidender Faktor für postnatale rassenspezifische Muskeleigenschaften in zwei Rassen. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) und Western Blot Ergebnisse zeigten, dass die Myf6 mRNA- und Protein-Expression dramatisch höher bei Pietrain im Vergleich zu Duroc Schweinen waren. Dieses kann auf eine rassenspezifische Expression hindeuten. Variationen in der DNA-Methylierung des Myf6 Gens in der 5´regulierenden Region, speziell innerhalb wichtiger Transkriptionsfaktorbindeelementes, konnten zwischen den Rassen ermittelt werden. Doch zeigte sich bei der Rasse Pietrain, dass eine höhere Expression von Myf6 nicht übereinstimmend mit dem Hypermethylierungsstatus ist, sondern mit einer hohen E2F1 Expression konkurriert. Zusätzlich zu den praktischen Implikationen erweitert diese Studie unser Verständnis über die Rolle des epigenetischen Mechanismus in postnatalen Schweinen. Für die <em>in vitro</em> Studie wurden Satellitenzellen als Muskelstammzellen, die das postnatale Muskelwachstum unterstützen, verwendet. Sulforaphane (SFN), ein neuartiger und natürlicher Histon Deacetylase (HDAC) Inhibitor, wurde als ein epigenetisches Behandlungsreagenz ausgewählt. Neben SFN setzten wir weitere typische epigenetische Reagenzien wie 5- Aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC) und Trichostatin (TSA) ein. Im Gegensatz zu TSA zeigen SFN und 5-aza-dC die Eigenschaft, nicht nur die HDAC Aktivität zu unterdrücken sondern auch die DNA-Methyltransferase Expression (DNMT) und die Expression von Myostatin (MSTN). SFN, 5-aza-dC und TSA weisen unterschiedliche Mechanismen auf, um die Expression von MSTN und negativen Regulatoren des MSTN Signalwegs zu unterdrücken. Deregulierte miRNA wird vielleicht von der epigenetischen Unterdrückung von MSTN ausgenommen. Jedoch kann die epigenetische Unterdrückung von MSTN durch 5-aza-dC und SFN mit einer verringerten Myoblast Determination Protein (MyoD) Expression assoziiert werden durch reduzierte Bindung von MyoD an den MSTN Promotor und Hypoacetylierung der MyoD Bindungsstelle. Diese Beobachtungen manifestieren einen neuartigen Mechanismus zur Manipulation des Muskelzellphänotypen.