Die modulierende Wirkung von Aptameren auf die Eigenschaften und Funktionen von Thrombin

Abstract

Thrombin ist ein multifunktionelles Enzym, dem eine zentrale Rolle in der Aktivierung und Regulation der Gerinnungsantwort zukommt. Dazu interagiert es mit verschiedenen makromolekularen Substraten. Auf molekularer Ebene werden diese Interaktionen durch Molekülregionen, sogenannte Exosites, gesteuert. Die Entwicklung der Aptamere (einzelsträngige DNA Moleküle) HD1, HD22 und des Fusionsaptamers HD1-22 macht es möglich, gezielt die Exosite 1 (HD1) oder 2 (HD22) oder beide Exosites (HD1-22) zu blockieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Aptamerwirkung auf die Bindungseigenschaften von Antithrombin, Heparin und Thrombomodulin an Thrombin, mit Hilfe der amidolytischen Aktivität von Thrombin im Flouorometer und im Thrombingenerierungs-Assay, zu untersuchen und die zeitliche Stabilität der Aptamer-Thrombinkomplexe mit dem Antithrombin-Thrombin-Komplexen (TAT)-ELISA darzustellen. Außerdem sollte die Exositeselektivität der einzelnen Aptamere genutzt werden, um mögliche intramolekulare Exosite-Wechselwirkungen und deren Auswirkungen auf die Thrombinaktivität zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle Aptamere die Bindung von Antithrombin, Heparin und Thrombomodulin an Thrombin unterschiedlich stark verhindern können. Diese Eigenschaften der Aptamere werden durch die direkte Blockade der Exosites erzeugt. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass die Bindung der Aptamere HD 1 und HD 22 nicht nur die Bindungspartner der korrespondierenden Exosite beeinträchtigen, sondern auch die nicht unmittelbar in die Bindung involvierte Exosite und das Aktive Zentrum beeinflussen. Diese Ergebnisse konnten die Theorie der intramolekularen Konformationsänderung, die durch die Exositebindung induziert wird und zwischen den beiden Exosites und dem Aktiven Zentrum besteht, bestärken. Eine Betrachtung der Aptamereffekte auf die Bindung von Thrombin an Thrombomodulin konnte zeigen, dass die Aptamerwirkung im gereinigten System und im Plasma unterschiedlich ist. Während im gereinigten System die Aptamere die Anlagerung von Thrombin an Thrombomodulin teilweise inhibieren, kommt es im Plasma zu einer Verstärkung der Thrombin-Inhibition, da es entweder zu einer effektiveren Blockierung der positiven Feedbackschleife (über Faktor V und VIII) kommt oder die Aptamere mit ihrem anionischem Charakter eine heparinartige Funktion ausüben und die Bindungsfähigkeit von PCI an dem Thrombin-Thrombomodulinkomplex beschleunigen. Des Weiteren konnte die Stabilität der Aptamer-Thrombin-Komplexe in defibrinisierten Plasma dargestellt werden. Es ergab sich eine Halbwertszeit der Aptamer-Thrombin-Komplexe für HD1 von 1,5 Minuten, für HD22 von 3,25 Minuten und für HD1-22 von 4,5 Minuten. Die erhobenen Befunde verdeutlichen, dass mit den Exosite-spezifischen Aptameren selektiv verschiedene Thrombinfunktionen blockiert werden können.