Morphological reflectors and molecular predictors of preimplantation developmental competence in bovine oocytes and embryos

Abstract

The efficiency of in vitro production (IVP) of bovine embryos still remains low, reaching blastocyst rates between 25 and 35 %. Accordingly, the necessity to define reliable predictors for developmental competence is indispensible. Up to now most morphological and molecular markers are subjective and partly invasive and thus relatively inaccurately. Therefore, the aim of the first experiment of the present approach was to evaluate the effect of structural changes in zona pellucidas’ (ZP) morphology during in maturation on developmental competence using polarized light microscopy. Structural changes in terms of number and size of pores were displayed by the Scanning electron microscopy and determined quantitatively in zona pellucida birefringence (ZPB). Immature oocytes classified as high presumble quality oocytes exhibited highest values for birefringence, and in vivo matured oocytes showed the lowest values for birefringence compared to their in vitro matured counterparts. These results implicate, that decreasing values for ZPB during maturation are typical for high developmental competence. In the second study of the present thesis, the transcriptome profile of one blastomere of a bovine 2-cell stage embryo was directly correlated with the developmental potential of the corresponding sister blastomere. Analyses using microarray technology revealed specific molecular fingerprints for blastomeres whose sister blastomere developed to the blastocyst stage in contrast to those blastomeres whose sister blastomeres stopped cleaving after separation or were blocked before embryonic genome activation (EGA). Pathway analyses uncovered, that differentially regulated genes (DEG) were mostly involved in oxidative phosphorilation, oxidative stress response and antioxidant activity. Five candidate genes, namely, <em>NDUFS1, MAPK14, CAT, PRDX1 </em>and<em> PRDX6</em>, which are known to act as either direct or indirect scavengers of reactive oxygen species (ROS), were selected and their expression levels were further characterized using two independent models for developmental competence. Furthermore, ROS staining revealed high ROS accumulations in late cleaved or rather developmentally incompetent 2-cell stage embryos, compared to low ROS levels in early cleaved and therefore presumable highly competent 2-cell stage embryos. Taken together, noninvasive morphological criteria predicting subsequent developmental competence of matured bovine oocytes were identified in this work. Moreover, a direct correlation between molecular mechanisms and the individual developmental competence, which was found to be already determined in the 2-cell stage, could be detected.

<strong>Untersuchungen boviner Eizellen und Embryonen auf morphologischer und molekularer Ebene zur Identifizierung von entwicklungsrelevanten Markern</strong><br /> In Anbetracht der relativ geringen Effizienz der in vitro Produktion (IVP) boviner Embryonen mit Blastozystenraten von 25 bis 35 %, ist es unverzichtbar, zuverlässige Prädiktoren für das Entwicklungspotential von Eizellen und Embryonen zu definieren. Bis heute sind die meisten morphologischen und molekularen Qualitätsparameter subjektiv und von invasiver Natur. Daher war es das Ziel in der ersten Studie der vorliegenden Arbeit, strukturelle Veränderungen in der Zona pellucida (ZP) während der in vitro Maturation (IVM) mit Hilfe der Polarisationslichtmikroskopie quantitativ zu erfassen und mit dem Entwicklungspotential zu korrelieren. Strukturelle Änderungen bezogen auf Anzahl und Größe der Poren in der ZP zeigten sich bei der Analyse mittels eines Rasterelektronenmikroskops und spiegelten sich in der Doppellichtbrechungsintensität der Zona pellucida (ZPB) quantitativ wieder. Immature Eizellen, die als qualitativ sehr gut eingestuft wurden, zeigten die höchsten Werte für die ZPB, wohingegen die in vivo maturierten Eizellen im Vergleich zu den in vitro maturierten die niedrigsten Werte aufwiesen. Diese Ergebnisse implizieren, dass abnehmende Werte für die ZPB während der Maturation als Pärdiktor für hohe Eizellqualität genutzt werden können. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Polarisationslichtmikroskopie als nicht invasisver Prädiktor für das Entwicklungspotential genutzt werden kann. In der zweiten Studie der vorliegenden Arbeit wurde eine direkte Korrelation zwischen dem Transkriptionsprofil einer Blastomere eines bovinen Zweizellers zum Entwicklungspotential der korrespondierenden Schwesterblastomere hergestellt. Beim Vergleich mittels Mikroarraytechnologie wurden spezifische molekulare Fingerabdrücke für Blastomeren ermittelt, deren Schwesterblastomeren sich zur Blastozyste entwickelten im Gegensatz zu denen, deren Schwesterblastomeren sich nicht weiter teilten oder vor der embryonalen Genomaktivierung (EGA) geblockt wurden. Nach Analyse der durch die differentiell regulierten Transkripte betroffenen Stoffwechselwege zeigte sich, dass diese Gene hauptsächlich in oxidative Phosphorilierung, oxidative Stressantwort und antioxidative Aktivität involviert waren. Die Expremierung der daraus selektierten Kandidatengene <em>NDUFS1, MAPK14, CAT, PRDX1 </em>und<em> PRDX6</em>, deren direkte und indirekte Funktionen bei der Eliminierung von freien Radikalen bekannt ist, wurde an Hand von zwei unabhängigen Kompetenzmodellen weiter charakterisiert. Des Weiteren zeigte Färbung, dass spät geteilte Zweizeller mit einem geringeren Entwicklungspotential sehr hohe Anreicherungen an freien Radikalen aufwiesen im Gegensatz zu früh geteilten Zweizellern mit einem hohen Entwicklungspotential, die nur niedrige Anreicherungen zeigten. Schlussfolgernd konnte gezeigt werden, dass spezifische molekulare Mechanismen direkt mit dem Entwicklungspotential korrelieren und es bereits im Zweizeller determinieren.