Characterisation of fitness parameters and population dynamics of Botrytis cinerea for the development of fungicide resistance management strategies in grapevine

Abstract

Gray mold caused by the fungus<i>Botrytis cinerea</i> is an economically important disease in grapevine. The pathogen has a high tendency to become resistant to frequently applied systemic fungicides. Only a few years after introduction of the fungicide class of benzimidazoles (MBC), resistant strains appeared frequently in European vineyards. Since the discontinuation of the use of benzimidazoles to control <i>B. cinerea</i> in 1975, the frequency of MBC-resistant strains decreased significantly. In the present study, the influence of fungicide resistance management strategies on the population dynamics of <i>B. cinerea</i> isolates resistant to fungicides was investigated in a three year field trial at three sites near Bordeaux. The tested strategies were mixture, alternation and annual alternation of thiophanate-methyl (TM) and mepanipyrim (MP). Strategies were compared to the solo application of TM and conventional fungicide treatments, where no TM was applied. Frequencies of fungicide-resistant isolates were determined in monitoring procedures conducted prior and subsequent to fungicide applications.<br /> In all three years, spray programs including TM resulted in significantly higher frequencies of TM-resistant isolates (BenR1 phenotype) compared to those detected in conventionally treated plots. In the first year, all strategies tested led to similar BenR1 isolate frequencies compared to the solo application of TM (23%). In the second year, solo application of MP as part of the annual alternation resulted in significantly lower BenR1 isolate frequencies (16%) compared to spray programs including TM (39%). However, at the end of the study no significant differences in BenR1 isolate frequencies were detected between the strategies tested and the solo application of TM (47%). Different single nucleotide polymorphisms (SNP) in the beta-tubulin gene confer resistance to MBC fungicides. Allele-specific polymerase chain reactions (as-PCR) as well as EvaGreen real-time as-qPCR showed a high correlation between the BenR1 isolate and E198A allele frequency. Over the winter period 2009/10, a decrease of BenR1 isolate frequency was detected (-12%), which points to difference in fitness of MBC-sensitive (BenS) and BenR1 isolates. Therefore, various fitness parameters were tested comparing ten BenS with ten BenR1 isolates. At favourable conditions, no significant differences were detected between the two sensitivity groups. At unfavourable conditions, mycelium growth, lesion size and spore production of BenS isolates were significantly higher than those of BenR1 isolates. In a competitive assay on leaf discs as well as on grapevine plants a decrease in BenR1 conidia frequency of 7% per generation was observed. <br /> Fitness costs associated with resistance could have reduced the frequency of BenR1 isolates within the primary inoculum, when the fungus was confronted with unfavourable development conditions. If no MBC fungicides are applied during the season, then the short-distance dispersal of BenS conidia from the infected flowers and other sources leads to a decrease of the resistant fraction in the consecutive berry-associated population, as well. Over time, the difference in fitness leads to a linear decrease resulting in the low frequencies of BenR1 isolates as observed in German and French vineyards nowadays. A registration of the mixture of thiophanate-methyl with mepanipyrim would contribute to the diversity of modes of action controlling <i>B. cinerea</i>. Due to the emergence and development of resistance to single-site fungicides of all chemical classes, a resistance management strategy combining all tools available in an integrated pest management will be needed. Thus, a registration of the mixture of thiophanate-methyl with mepanipyrim will lead to a prolongation of the lifespan of newly introduced active ingredients to control <i>B. cinerea</i> in grapevine in the future.

<strong>Untersuchungen zur Fitness und Populationsdynamik von<i>Botrytis cinerea</i> zur Entwicklung einer Fungizid-Resistenzmanagement-Strategie im Weinbau</strong><br /> Der Erreger des Grauschimmels <i>Botrytis cinerea</i> verursacht hohen wirtschaftlichen Schaden durch Qualitätseinbußen und Ertragsverluste im Weinbau. Das Pathogen verfügt über eine hohe genetische Diversität, wodurch bei intensivem Fungizid-Einsatz resistente Stämme auftraten. Dies führte im Falle der 1971 eingeführten Benzimidazole (MBC) nach wenigen Jahren zu dem Entzug der Genehmigung für den Weinbau in Deutschland. Über 30 Jahre später wurde eine Abnahme des Anteils MBC-resistenter Isolate auf unter 10% festgestellt. In der aktuellen Studie wurde der Einfluss von Antiresistenz-Strategien auf die Entwicklung des Anteils Fungizid-resistenter <i>B. cinerea</i> Isolate im Rahmen eines dreijährigen Feldversuches an drei Standorten in der Nähe von Bordeaux geprüft. Als Strategien wurden der jährliche Wirkstoffwechsel, die Mischung und die Alternierung von Thiophanate-Methyl (TM) und Mepanipyrim (MP) geprüft. Diese Strategien wurden mit der Soloanwendung von TM und konventionellen Spritzfolgen, in denen kein TM angewendet wurde, verglichen. <br /> In allen drei Jahren führten Spritzfolgen mit TM im Vergleich zu den konventionell gespritzten Flächen zu signifikant höheren Anteilen TM-resistenter Isolate (BenR1). Im ersten Jahr führten alle geprüften Strategien im Vergleich zu der Soloapplikation von TM zu ähnlichen Anteilen von BenR1 Isolaten (23%). Im zweiten Jahr führte die Soloapplikation von MP im Rahmen des jährlichen Wirkstoffwechsels zu signifikant niedrigeren Anteilen von BenR1 Isolaten (16%) im Vergleich zu den anderen Strategien (39%). Am Ende der Studie zeigten sich nach Anwendung der geprüften Strategien und der Soloapplikation von TM ähnlich hohe Anteile von BenR1 Isolaten (47%). Resistenzen gegenüber MBC-Fungiziden werden durch verschiedene Punktmutationen auf dem beta-Tubulin-Gen verursacht. Diese Mutationen wurden mittels allel-spezifischer Polymerase-Kettenreaktionen (as-PCR) und EvaGreen real-time as-PCR nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine enge Korrelation zwischen dem Auftreten von BenR1 Isolaten und dem Nachweis der E198A-Mutation. Im Anschluss an die Winterperiode 2009/10 wurde eine Abnahme des Anteils von BenR1 Isolaten festgestellt (-12%). Daher wurden Fitnessparameter von zehn BenS und zehn BenR1 Isolaten miteinander verglichen. Unter günstigen Wachstumsbedingungen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Sensitivitätsgruppen. Unter ungünstigen Wachstumsbedingungen wurden signifikant höhere Myzelwachstumsraten, Läsionsdurchmesser und Sporenproduktion von BenS im Vergleich zu BenR1 Isolaten gemessen. In kompetitiven Untersuchungen auf Blattscheiben sowie Weinreben wurde eine Abnahme des Anteils von BenR1 Konidien von 7% je Generation gemessen. <br /> Dieser Fitnessunterschied könnte den Anteil von BenR1 Isolaten innerhalb des Primärinokulums, wenn der Pilz mit ungünstigen Entwicklungsbedingungen konfrontiert wird, reduziert haben. Wenn keine Benzimidazole appliziert werden, dann würde die Verbreitung der MBC-sensitiven Isolate von den infizierten Blüten aus zu einer Abnahme des Anteils von BenR1 Isolaten in der anschließend die Beeren infizierenden Population führen. Über einen längeren Zeitraum betrachtet würde dies zu einer linearen Abnahme des Anteils der BenR1 Isolate führen bis hin zu den niedrigen Anteilen, die derzeit in deutschen und französischen Weinbergen beobachtet werden. Eine Zulassung von Thiophanate-Methyl in Mischung mit Mepanipyrim kann nur durch genau definierte Empfehlungen für das Resistenzmanagement erfolgen. Dadurch würde die Diversität der Wirkstoffe erweitert und eine Verlängerung des Nutzungszeitraums von neu entwickelten Wirkstoffen zur Bekämpfung von <i>B. cinerea</i> im Weinbau in der Zukunft ermöglicht werden.