Adiponectin in Cattle: Profiling of molecular weight patterns in different body fluids at different physiological states and assessment of adiponectin’s effects on lymphocytes

Abstract

Adiponectin (AdipoQ), one of the most abundant adipokines found in circulation exerts various meta-bolic functions, e.g. improving insulin sensitivity and ameliorating tissue inflammation. It is secreted in different molecular weight (MW) forms: a low molecular weight (LMW) trimer, a middle molecular weight (MMW) hexamer and a high molecular weight (HMW) form which is built of 12 to 18 mono-mers. Dairy cows undergo various metabolic changes in the time from late pregnancy to early lacta-tion. This causes a mobilization of body reserves which may lead to a higher risk for infectious diseas-es and possible problems in fertility later. The aims of this thesis were (1) to establish a semi-quantitative Western blot to estimate AdipoQ concentrations in serum and milk of lactating dairy cows; (2) to develop a semi-native Western blot to differentiate AdipoQ MW patterns in several bo-vine body fluids and tissues. (3) to estimate potential influences of AdipoQ on lymphocyte function; for this purpose AdipoQ was recombinantly expressed in <em>Escherichia coli</em>.<br /> First, the AdipoQ serum concentration in late pregnancy and the entire lactation as well as the concen-trations in milk from d 1 to d 24 in lactation were estimated. Subsequently, a profile of the AdipoQ MW forms in serum and milk of dairy cows at different time points in lactation was generated. Fur-thermore, the MW patterns of AdipoQ in two different adipose tissue (AT) depots (visceral and subcu-taneous) at three different days (1, 42, and 105) after parturition were investigated. In addition the MW patterns of AdipoQ in the mammary gland were shown. The AdipoQ MW forms in cerebrospinal fluid (CSF) and corresponding serum of transition cows were characterized. Moreover the AdipoQ MW patterns in other <em>Bovidae</em>, i.e.Yak, Bison and Water buffalo were characterized. As body fluids in rela-tion to reproduction we investigated the AdipoQ MW patterns in allantoic fluid (AF) and correspond-ing maternal serum. In addition the AdipoQ concentrations and MW patterns in seminal plasma (SP) of bulls and follicular fluid (FF) of heifers were evaluated. Independent of the MW patterns, the func-tional effect of recombinant AdipoQ on lymphocyte proliferation was studied.<br /> Adiponectin concentration in serum and milk showed an inverse course. Serum AdipoQ decreased until parturition and increased in early lactation, whereas AdipoQ concentration in milk was highest at the onset of lactation and decreased reaching a nadir in the first week of lactation. The changes in cir-culating AdipoQ are probably related with the hormonal changes associated with parturition. The MW patterns of serum and milk showed a prominent MMW band and a faint HMW band. In contrast to the MW patterns observed in humans we speculate that the MMW form of AdipoQ might be the most abundant one in cattle; in Yak, Bison and Water buffalo, the MMW AdipoQ was also the most promi-nent one. Different AT and mammary gland homogenates showed no differences in molecular weight pattern of AdipoQ. At each stage of lactation the HMW and the MMW band was detectable. CSF and serum samples of individual days in transition period showed no apparent differences in the MW pat-tern of AdipoQ. The AdipoQ MW pattern in AF was different to the AdipoQ MW pattern seen in se-rum before. AdipoQ was mainly detected as the HMW form, which might indicate that AF AdipoQ is not derived from circulation and might be of fetal origin. In bulls AdipoQ serum concentrations corre-lated with the ones in SP and the MW distribution was mainly the same. AdipoQ MW pattern in FF of heifers was different to the serum MW pattern; The HMW band was virtually absent in FF independ-ent of the stage of the estrous cycle. Recombinant AdipoQ reduced mitogen induced lymphocyte pro-liferation which indicates that AdipoQ might be involved in the immune suppression. The results of this thesis provide AdipoQ profiles in several bovine body fluids. The physiological function of the individual AdipoQ isoforms needs to be further investigated.

<strong>Adiponektin beim Rind: Darstellung der Molekulargewichtsformen in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten in verschiedenen physiologischen Zuständen und Ermittlung des Adiponectineffekts auf Lymphozyten</strong><br /> Adiponektin (AdipoQ) ist eines der am häufigsten in der Zirkulation vorkommenden Adipokine. Es beeinflusst verschiedene metabolische Prozesse und trägt zur Verbesserung der Insulinsensitiviät und der Eindämmung von Entzündungen im Gewebe bei. Die Sekretion erfolgt in drei unterschiedlichen Molekulargewichtsformen (MW): als Trimer in der niedermolekularen Form (low molecular weight, LMW), als Hexamer in der mittleren Molekularform (middle molecular weight, MMW), sowie als multimere hochmolekulare Form (high molecular weight, HMW), bestehend aus 12-18 Monomeren. Milchkühe sind in der Zeit der späten Trächtigkeit und frühen Laktation vielen metabolischen Verän-derungen ausgesetzt. Die Mobilisierung von Körperreserven kann zu einem erhöhten Risiko für Infek-tionskrankheiten führen und beeinflusst möglicherweise auch die spätere Fortpflanzungsleistung. Ziel dieser Arbeit war (1) die Etablierung eines semi-quantitativen Western Blots zur Bestimmung der AdipoQ-Konzentration in Serum und Milch von Milchkühen im geburtsnahen Zeitraum. Zusätzlich erfolgte (2) die Entwicklung eines semi-nativen Western Blots, um die unterschiedlichen MW von AdipoQ in verschiedenen Köperflüssigkeiten und Geweben zu charakterisieren. Desweiteren wurden (3) mögliche Auswirkungen von AdipoQ auf die Funktionsfähigkeit von Lymphozyten untersucht. Hierzu wurde AdipoQ rekombinant in <em>Eschericha coli</em> hergestellt. Im ersten Schritt wurde die Adi-poQ-Konzentration in Serum von Milchkühen während der späten Trächtigkeit sowie im Verlauf der Laktation bestimmt, anschließend in Milch im Zeitraum vom 1. bis zum 24. Tag der Laktation. Im Anschluss erfolgte die Erstellung eines Molekulargewichtprofils in Serum und Milch von Milchkühen in der frühen und mittleren Laktation. Darüber hinaus wurden die MW von AdipoQ in zwei verschie-denen Fettgeweben (adipose tissue, AT) (viszeral und subkutan) an Tag 1, 42 und 105 der Laktation, sowie in der Milchdrüse gezeigt. Weiterhin wurde das MW-Profil von AdipoQ in zerebrospinaler Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF) und korrespondierendem Serum von Milchkühen im peripartalen Zeitraum untersucht. In einem weiteren Schritt erfolgte die Ermittlung der AdipoQ-Konzentration und des MW-Profils in Serum und Reproduktionsflüssigkeiten von Rindern; Seminalflüssigkeit (seminal plasma, SP) von Bullen, sowie Follikelflüssigkeit (folicular fluid, FF) und Fruchtwasser (alantois fluid, AF) von Färsen. Überdies konnten die MW von AdipoQ auch in artver-wandten Spezies der Rinder (Yak, Bison, Wasserbüffel) dargestellt werden. Unabhängig vom MW wurden die Auswirkungen von AdipoQ auf die Proliferation von Lymphozyten bestimmt. Die Serum- und Milch-AdipoQ-Konzentrationen verliefen gegenläufig, im Serum sank die Konzentrationen bis zur Geburt und stieg danach wieder an. In Milch sank die AdipoQ-Konzentration im Verlauf der ers-ten Laktationswoche wieder. Die Veränderungen der AdipoQ Konzentrationen stehen vermutlich in Verbindung mit den hormonellen Veränderungen im geburtsnahen Zeitraum.<br /> Das Profil der AdipoQ-MW in Serum und Milch zeigte eine prominente MMW-Bande und eine feine HMW Bande. Anders als beim Menschen könnte beim Rind die MMW die vorherrschende AdipoQ-Form darstellen. Auch in Yak, Bison und Wasserbüffel war die MMW die prominenteste Bande. In den verschiedenen AT und der Milchdrüse konnte kein Unterschied im AdipoQ-MW bestimmt wer-den. Zu jedem Zeitpunkt in der Laktation konnte eine MMW und eine HMW Bande detektiert werden. CSF und Serum von unterschiedlichen Zeitpunkten in der Übergangsphase zeigten keinen Unterschied in den MW von AdipoQ. In AF konnte nur eine HMW-Bande nachgewiesen werden nicht wie im Serum, was dafür spricht, dass AF-AdipoQ nicht aus der Zirkulation kommt und möglicherweise föta-len Ursprungs ist. In Bullen korrelierte die AdipoQ-Serumkonzentration mit der im SP und auch die MW-Formen waren sich ähnlich. Die MW-Verteilung in FF und Serum war unterschiedlich, in FF war nur die MMW Bande zu finden, unabhängig vom Zeitpunkt im Zyklus. Rekombinant produziertes AdipoQ war in der Lage die Lymphozyten-proliferation zu senken, was darauf hindeuten könnte, dass AdipoQ Einfluss auf eine Immunsuppression haben könnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation geben einen Überblick über die AdipoQ MW-Profile in unterschiedlichen bovinen Körperflüssigkeiten und Geweben.