Molecular characterization of the maize <em>(Zea mays L.) AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID (Aux/IAA)</em> gene family

Abstract

The phytohormone auxin is an important molecular component in plant signal transduction. As an endogenous signaling molecule, auxin controls many aspects of plant development. Members of the <em>AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID (Aux/IAA</em>) gene family play an important role in auxin signal transduction. <br /> The <em>rum1 (rootless with undetectable meristem 1</em>) gene encodes the Aux/IAA protein ZmIAA29, which is to date the only Aux/IAA member with an assigned function in plant development in maize. It controls the initiation of the embryonic seminal roots and post-embryonic lateral roots of the primary root. Based on the function of <em>rum1</em> in root development a comprehensive characterization of the <em>Aux/IAA </em>gene family was initiated in this study.<br /> At the beginning of this study 31 <em>Aux/IAA</em> genes were known. A homology search for novel <em>Aux/IAA</em> sequences in the latest maize genome assembly version identified three unknown Aux/IAA genes (<em>ZmIAA32</em> - GRMZM2G366373, <em>ZmIAA33</em> – GRMZM2G359924, <em>ZmIAA34</em> – GRMZM2G031615). Phylogenetic reconstructions of the 34 Aux/IAA proteins revealed two classes of Aux/IAA proteins that can be distinguished by alterations in their domain III. Moreover, seven pairs of paralogous maize Aux/IAA proteins were discovered via syntenic comparisons. Comprehensive root-type and tissue-specific expression profiling revealed unique expression patterns of the diverse members of the gene family. The <em>Aux/IAA </em>genes displayed their highest expression in crown roots followed by seminal and primary roots. Lateral roots of the primary root displayed the lowest <em>Aux/IAA</em> expression level. Based on the results of the phylogenetic and expression studies five members of the maize <em>Aux/IAA</em> gene family, <em>ZmIAA2, ZmIAA11, ZmIAA15, ZmIAA20 </em>and<em> ZmIAA33</em>, were functionally characterized. Alternative protein variants were generated via the introduction of specific point mutations in the degron sequence by substituting the first proline by serine or the second proline by leucine. In general, Aux/IAA proteins are short-lived and localized in the nucleus. The five Aux/IAA protein half-life times ranged between ~11 min (ZmIAA2) to ~120 min (ZmIAA15) while the mutated forms were more stable. Subcellular localization studies revealed that ZmIAA2, ZmIAA11 and ZmIAA15 and their mutated forms were exclusively localized in the nucleus, whereas ZmIAA20 and ZmIAA33 were detected in nucleus and cytoplasm. Furthermore, all five maize Aux/IAA proteins were acting as active repressors. In addition, interaction of RUM1 with all five Aux/IAA proteins was detected, but only ZmIAA15 and ZmIAA33 interacted with the RUM1 paralog RUL1. <br /> In summary, the analyzed <em>Aux/IAA</em> genes displayed root-, tissue- and development specific expression patterns. Furthermore, the selected Aux/IAA proteins revealed different half-life times together with various activity of their repressor function. All five Aux/IAA proteins were localized in the nucleus; ZmIAA20 and ZmIAA33 were additionally expressed in the cytoplasm. Finally, specific protein interactions were identified between the selected Aux/IAA proteins with RUM1 and RUL1.

Dem Phytohormon Auxin ist ein wichtige Komponente der pflanzlichen Signaltransduktion. Als endogener Signalstoff steuert Auxin vielfältige Aspekte der pflanzlichen Entwicklung. Mitglieder der <em>AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID (Aux/IAA)</em> Genfamilie spielen eine zentrale Rolle in der Auxin-Signaltransduktion.<br /> In Mais kodiert das Gen <em>rum1 (rootless with undetectable meristem 1)</em> das Aux/IAA Protein ZmIAA29, dem bislang als einzigem Aux/IAA Protein eine Rolle in der Entwicklung zugeschrieben werden konnte. Es kontrolliert die Initiation der embryonalen Seminalwurzeln und der postembryonalen Lateralwurzeln der Primärwurzel. Ausgehend von diesem Befund wurde in dieser Arbeit die <em>Aux/IAA</em> Genfamilie von Mais genauer charakterisiert.<br /> Zu Beginn dieser Arbeit waren 31 <em>Aux/IAA</em> Gene im Maisgenom beschrieben. Eine Homologiesuche in der aktuellsten Annotation des Maisgenoms führte zur Identifizierung von drei weiteren <em>Aux/IAA </em>Genen (<em>ZmIAA32</em> – GRMZM2G366373, <em>ZmIAA33</em> – GRMZM2G359924 und <em>ZmIAA34</em> – GRMZM2G031615). Phylogenetische Analysen aller 34 Aux/IAA Proteine ergaben eine strukturelle Aufspaltung des Stammbaums in zwei Klassen aufgrund von Unterschieden der Aminosäuresequenz in der konservierten Domäne III. Insgesamt konnten durch Syntänievergleiche sieben paraloge <em>Aux/IAA</em> Paare bestimmt werden. Die <em>Aux/IAA</em> Gene zeigten unterschiedliche Expressionsmuster in verschiedenen Wurzeltypen. Im Durchschnitt war das Expressionsniveau der Aux/IAA Gene in den Kronwurzeln am höchsten, gefolgt von den Seminal- und Primärwurzeln. Die geringste Expression wurde in den Lateralwurzeln der Primärwurzel gemessen. Basierend auf den Ergebnissen der phylogenetischen Untersuchungen und der Expressionsanalysen wurden die <em>Aux/IAA </em>Gene<em> ZmIAA2, ZmIAA11, ZmIAA15, ZmIAA20 </em>und<em> ZmIAA33</em> für die weitere funktionelle Charakterisierung ausgewählt. Alternative Varianten dieser Proteine wurden durch zielgerichtete Punktmutationen erzeugt, die dazu führten, dass in den Degron-Sequenzen der fünf Aux/IAA Proteine das primäre Prolin durch Serin und das sekundäre Prolin durch Leuzin ersetzt wurden. Aux/IAA Gene kodieren für kurzlebige Proteine, welche im Kern lokalisiert sind. Die gemessenen Halbwertszeiten der untersuchten wildtypischen Aux/IAA Proteine betrugen zwischen ~11 Minuten (ZmIAA2) und ~120 Minuten (ZmIAA15). Die Punktmutationen führten zu einer deutlichen Stabilisierung der Aux/IAA Proteine im Vergleich zu den Wildtypvarianten. Die Wildtyp- sowie die mutierten Proteine von ZmIAA2, ZmIAA11 und ZmIAA15 wurden ausschließlich im Kern nachgewiesen. Dagegen waren die Proteine ZmIAA20 und ZmIAA33 in Kern und Zytoplasma lokalisiert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass alle<em> Aux/IAA</em> Kandidatengene als aktive Repressoren fungieren. Weiterhin konnte eine Wechselwirkung der fünf untersuchten Aux/IAA Proteine mit RUM1 gezeigt werden, jedoch interagierten nur ZmIAA15 und ZmIAA33 mit dessen Paralog RUL1.<br /> Zusammenfassend konnte nachgewiesen werden, dass die untersuchten <em>Aux/IAA</em> Gene wurzel-, gewebe- und entwicklungsspezifische Expressionsmuster aufwiesen, darüber hinaus zeigten die von diesen Genen kodierten Proteine unterschiedliche Stabilitäten sowie eine unterschiedlich starke Repressoraktivität. Während alle fünf Aux/IAA Proteine im Kern lokalisiert waren, zeigten <em>ZmIAA20 </em>und<em> ZmIAA33</em> zusätzlich Expression im Zytoplasma. Schließlich wurden spezifische Protein-Protein-Interaktionen der Aux/IAA Proteine mit RUM1 und RUL1 identifiziert.