iPS-abgeleitete humane Mikroglia als neuroinflammatorisches in-vitro Modell der Amyotrophen Lateralsklerose

Abstract

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist die häufigste Motorneuronerkrankung des Erwachsenen, welche aufgrund der fehlenden Therapiemöglichkeiten eine infauste Prognose hat. Es existieren eine familiäre und eine sporadische Form. Das allgemein akzeptierte Tiermodell bildet die Gruppe der häufigsten familiären ALS-Fälle nach und beruht auf einer Mutation des Gens für Superoxiddismutase 1 (SOD1). Obwohl primär als Erkrankung der Motorneurone klassifiziert, zeigte sich im Tiermodell, dass SOD1-Mutationen in Mikroglia und Astrozyten für die Progression der Erkrankung verantwortlich sind. Mutantes SOD1 exprimierende Mikrogliazellen produzieren im Tiermodell größere Mengen an neurotoxischen Zytokinen wie TNFα und reaktiven Sauerstoffradikalen, die zum Untergang von Neuronen führen. Es wurden mitochondriale Schäden an pathologischen post-mortem Untersuchungen bei ALS-Patienten sowie im mSOD1-Maus- und in-vitro-Modell nachgewiesen.<br /> In der vorliegenden Arbeit wurden SOD1-GFP-Fusionsgene mit humanem wt-SOD1 sowie den SOD1-Mutanten G37R, G85R und G93A in den lentiviralen Vektor pLL3.7 kloniert. Zur Expression in Mikrogliazellen wurde der PGK-Promoter vor die SOD1-GFP-Konstrukte kloniert. Damit wurden humane Mikrogliazellen transduziert, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen von re-programmierten Fibroblasten eines gesunden Spenders generiert wurden. Die transduzierten Mikrogliazellen konnten mit Hilfe des GFP-Signals durchflusszytometrisch sortiert und die GFP-positiven Zellen weiter kultiviert werden. Die transduzierten Zellen wurden immunzytochemisch auf SOD1 angefärbt. Im confocalen Mikroskop konnte eine deutliche mikrogliale Expression des mutanten SOD1 nachgewiesen werden. Die Aktivität der mitochondrialen Atmungskette wurde mit und ohne Stimulation der Mikrogliazellen photometrisch bestimmt; es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Aktivität der Komplexe I und IV der mitochondrialen Atmungskette oder in der Aktivität der Citratsynthase beobachtet.<br /> Es wurde zudem die Produktion von Superoxidanionen mithilfe des Farbstoffes Dihydroethidium gemessen. Hier zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Zelllinien. Zellen der Linien SOD1 wt sowie SOD1 G37R wiesen die höchste Superoxid-Produktion auf, es zeigte sich aber nicht wie erwartet eine höhere Superoxidproduktion bei allen mit mSOD1 transduzierten Mikrogliazellen im Vergleich zur SOD1 wt Linie.<br /> Es konnte gezeigt werden, dass sich die iPSdM prinzipiell gut als Zellkulturmodell zum Studium neurodegenerativer Erkrankungen eignen. Sie lassen sich stabil genetisch modifizieren und zeigen ein gutes Proliferationsverhalten, sodass für funktionelle Untersuchungen stets genügend Zellen zur Verfügung stehen.