Effect of sub-clinical endometritis on miRNAs expression profile of endometrial and oviductal epithelium and its implication of early embryonic development

Abstract

Understanding the molecular mechanisms associated with regulation of inflammatory responses during female genital tract infection is one step forward for development of diagnostic and therapeutic strategies in bovine reproduction. Therefore, the aim of this thesis was to investigate post-transcriptional regulation of inflammatory immune response genes during <em>LPS</em> treatment in bovine oviductal, endometrial cells and embryos. For this, two studies were conducted. In the first study, the mRNA expression analysis of inflammatory response genes (TNFα & IL1β) was performed in primary bovine oviductal cell culture and co-cultured blastocysts after minimum dose of <em>LPS</em> treatment <em>in vitro</em>. In the second study, the alterations of <em>let-7</em> miRNAs expression were addressed in primary bovine endometrial cells after <em>LPS</em> challenge (with clinical dose of 3.0 μg/ml or a sub-clinical dose of 0.5 μg/ml), as well as functional study of <em>let-7</em> miRNAs using gain and loss of function. While <em>LPS</em> treatment resulted in significantly up-regulation of pro-inflammatory cytokines (TNFα & IL1β) and stress response genes (SOD & CAT) in bovine oviductal cell and co-cultured blastocysts, the expression level of essential elements like OVGP1 and IGF2 was reduced in the challenged group compared to the untreated control. Interestingly, the over-expression of these proinflammatory cytokines in bovine oviductal cells was associated with aberrant expression of their potential regulatory miRNAs (miR-155, miR-146a, miR-223, miR- 21, miR-16 and miR-215). Furthermore, blastocysts co-cultured with oviductal cells in the presence of <em>LPS</em> showed reduced mitochondrial distribution pattern, higher ROS and apoptotic cells. A minimum dose of <em>LPS</em> challenge resulted in changes in relative abundance of <em>let-7</em> miRNAs in a time dependent-manner, where the peak expression of <em>let-7a</em> reached at 6h, while <em>let-7e, let-f </em>and<em> let-7i</em> peaked at 24h post treatment. Overexpression of <em>let-7a</em> inhibited pro-inflammatory cytokines (TNFα & IL6) on mRNAs as well as protein levels, while the <em>let-7a</em> inhibitor (antagonist) resulted in an increase in the expression of the same genes. The mRNAs and protein levels of TNFα, IL6 have shown a clear suppression upon transfection with <em>let-7f</em> inhibitor. In conclusion, infections in endometrial or oviductal microenvironment resulted in aberrant expression of genes and miRNAs which support the role of regulatory <em>let-7</em> miRNAs during bovine uterine infection by fine-tuning inflammatory cytokines.

<strong>Einfluss der subklinischen Endometritis auf miRNA-Expressionsprofile im Epithel von Endometrium und Eileiter sowie die Konsequenzen für die embryonale Frühentwicklung</strong><br /> Die Klärung von molekularen Mechanismen, die die Regulation einer Entzündungsreaktion während Infektionen des weiblichen Genitaltraktes begleiten, ist entscheidend für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Behandlungsmethoden in der bovinen Reproduktion. Daher war das Ziel dieser Studie die post-transkriptionale Regulation von Genen der entzündungsbedingten Immunreaktionen zu untersuchen.<br /> Dazu wurden innerhalb von zwei Forschungsansätzen bovine Zellen des Eileiters und des Endometriums sowie präimplantative Embryonen mit <em>LPS</em> behandelt. In der ersten Studie wurde die mRNA Expression von Genen der Entzündungsreaktion (TNFα& IL1β) in kultivierten primären bovinen Eileiterzellen und co-kultivierten Blastozysten <em>in vitro</em> gemessen, nachdem diese mit einer minimalen Menge an <em>LPS</em> behandelt wurden. In einem zweiten Experiment wurden die Veränderungen der <em>let-7</em> miRNAs Expression untersucht. Zu diesem Zweck wurden primäre bovine Zellen des Endometriums mit <em>LPS</em> behandelt (klinische Dosis (3.0 μg/ml) oder subklinische Dosis (0.5 μg/ml)) sowie eine funktionale Studie durchgeführt, um mögliche Funktionsnutzen und -verluste durch <em>let-7</em> miRNAs zu untersuchen.<br /> Die Behandlung mit LPS führte zur signifikanten Hochregulierung von proinflammatorischen Zytokinen (TNFα & IL1β) und Genen der Stressantwort (SOD & CAT) in bovinen Eileiterzellen und co-kultivierten Blastozysten. Die Expressionsniveaus von essentiellen Genen wie OVGP1 und IGF2 waren im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle reduziert. Interessanterweise ging die Überexpression dieser pro-inflammatorischen Zytokine in den Eileiterzellen mit einer abweichenden Expression ihrer potentiell regulierenden miRNAs (miR-155, miR-146a, miR-223, miR- 21, miR-16 und miR-215) einher. Darüber hinaus zeigten die Blastozysten, die mit den Eileiterzellen co-kultiviert wurden, bei der Behandlung mit <em>LPS</em> veränderte Muster der mitochondrialen Verteilung sowie erhöhte Anteile an ROS und apoptotischen Zellen. Der Einsatz einer minimalen Menge an <em>LPS</em> führte zu einer zeitabhängigen Veränderung der relativen Abundanz der <em>let-7</em> miRNAs, wobei die höchste Expression von <em>let-7a</em> nach 6h erreicht war, während <em>let-7e, let-f </em>und<em> let-7i</em> eine maximale Abundanz 24h nach der Behandlung zeigten. Die Überexpression von <em>let-7a</em> hemmte das mRNA- sowie das Proteinniveau der pro-inflammatorischen Zytokine, wohingegen der <em>let-7a</em> Inhibitor (Antagonist) zu einer Steigerung der Expression der gleichen Gene führte. Die mRNA- und Proteinniveaus von TNFα und IL6 zeigten eine deutliche Suppression nach der Transfektion mit dem <em>let-7f</em> Inhibitor.<br /> Abschließend lässt sich folgern, dass eine Infektion im Endometrium oder im Eileiter zu Veränderungen der Expressionen von Genen und miRNAs führte, welches die regulative Bedeutung von <em>let-7</em> miRNAs auf inflammatorische Zytokine während einer Infektion des bovinen Uterus unterstützt.