Innate immune responses of LPS treated porcine monocyte-derived dendritic cells after exposure to the histone deacetylase inhibitor sulforaphane

Abstract

Epigenetic mechanisms are believed to regulate the expression of immune gene and the development of inflammation. Dendritic cells (DCs) are crucial to sense microbial pathogens by their phagocytosis and by altering the expression of essential immune associated genes that are critical for initiation of innate and adaptive immunity. Therefore, it is possible to hypothesize that the DCs could undergo epigenetic modification towards maintaining the immunity homeostasis during inflammation. Thus, this study aimed to understand epigenetic mechanisms and associated gene expression changes in porcine DCs during infection using an in vitro model. For this, initial analysis was performed to select DCs that could exhibit a greater ability to initiate innate immune responses. To achieve this, porcine monocyte-derived DCs (moDCs) and splenic DCs (SDCs) were isolated and challenged with lipopolysaccharide (LPS). Following this, the expression level of immune related genes was analyzed using qRT-PCR and ELISA. The results unveiled that moDCs displayed higher mRNA levels of TLR4-related immune gene, and pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1ß and IL-8 compared to SDCs. Moreover, the flow cytometry and phagocytosis results indicated that the moDCs displayed a more potent maturation induction and phagocytic maintenance. Therefore, moDCs were chosen to be used for further epigenetic analysis. Moreover, sulforaphane (SFN) which is a natural histone deacetylase (HDAC) inhibitor was used t to induce the epigenetic modifications in moDCs. After pre-incubation with SFN, the moDCs were stimulated with LPS. Indeed, SFN was found to inhibit the global HDAC activity. Both SFN and LPS caused DNA methylation in exon 2 of TLR4 and in promoter region of MHC-SLA genes. Moreover, pre-incubation of SFN suppressed the TLR4 signal pathway and MHC-SLA gene which induced the transduction of inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1ß, IL-6 and IL-8) only before 3 to 6 h of LPS stimulation. On the other hand, SFN treatment of moDCs followed by LPS challenge induced DNA demethylation in the promoter region of MHC-SLA gene resulting in up-regulation of TLR4 and MHC-SLA gene expression. Inhibition of HDAC activity and DNA demethylation together by SFN treatment increased the expression level of immune genes after 6 h of LPS stimulation. Addtionally, SFN treatment impaired LPS-induced pro-inflammatory cytokine TNF-α and IL-1ß in the cell culture supernatants, but it induced an accumulation of TNF-α in the cell lysates of moDCs that may contribute to restrict the inflammation spreading. SFN also suppressed moDCs differentiation from immature to mature DCs through down-regulation of CD40, CD80 and CD86 molecules resulted in enhanced phagocytosis of moDCs. Thus, this study manifests a novel insight that HDAC inhibitor, SFN, exerts dynamic modulation on DC phenotypes including differential maturation and production of pro-inflammatory cytokines through epigenetic modifications to positively modify the innate immune responses in porcine moDCs.

<strong>Immunreaktion von mit Lipopolysaccharid behandelten porcinen Monozyten abgeleiteken dendritischen Zellen nach Einwirkung des Histonacetylase Inhibtors Sulforahan</strong><br /> Epigenetische Mechanismen regulieren die Expression von Immungenen und beeinflussen somit die Entwicklung von Entzündungen. Dendritische Zellen (DCs) sind entscheidend für die Erkennung von mikrobiellen Pathogenen durch ihre Phagozytose und die Änderung der Expression von Immungenen die für die Einleitung der angeborenen und adaptiven Immunität notwendig sind. Daher ergibt sich die Hypothese, dass epigenetische Veränderungen in DCs zu einer Herstellung der Imunitäts-Homöostase während einer Entzündung führen. Demnach, ist das Ziel dieser Studie epigenetische Mechanismen zu Verstehen und Veränderungen der Genexpressionen in Schweine DCs während einer Infektion in vitro zu untersuchen. Zunachst wuden Analyren durchgeführt, um DCs zu identifizieren, die eine größere Fähigkeit haben die unspezifische Immunantwort zu initiieren. Um dies zu erreichen, wurden Schweine Monozyten DCs (MoDCs) und Milz-DCs (SDCs) isoliert und mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelt. Anschließend wurde das Expressionsniveau von immunassoziierten Genen mittels qRT-PCR und ELISA analysiert. Die Ergebnisse ergaben, dass MoDCs im Vergleich zu SDCs ein höheres mRNA-Niveau von TLR4 und ein höheres Niveau von proinflammatorischen Zytokinen TNF- α, IL-1ß und IL-8 aufwiesen. Darüber hinaus, zeigten die Ergebnisse der Durchflusszytometrie und Phagozytose, dass die MoDCs eine stärkere Induktion der Reifung und phagozytische Aktivität hatten. Daher wurden für die weiteren epigenetischen Analysen MoDCs gewählt. Des Weiteren wurde Sulforaphan (SFN), ein natürlicher Histon-Deacetylase Inhibitor (HDAC) verwendet, um die epigenetischen Modifikationen in MoDCs zu induzieren. Nach Vorinkubation mit SFN wurden die MoDCs mit LPS stimuliert. Tatsächlich zeigte sich, dass SFN die globale HDAC-Aktivität hemmt. Sowohl SFN als auch LPS verursachen DNAMethylierung in Exon 2 des TLR4 und in der Promotorregion des MHC-SLA-Gens. Weiterhin unterdrückt die Vorinkubation mit SFN die TLR4 Signalwege und MHC-SLA, welche die Transduktion von inflammatorischen Cytokinen (TNF-α, IL-1ß, IL-6 und IL-8) nur von Stunde 3 bis 6 der LPS-Stimulation induzierten. Auf der anderen Seite, induziert die SFN Behandlung von MoDCs, gefolgt von LPS, DNA-Demethylierung in der Promotorregion des MHC-SLAGens, was zu einer Hochregulierung von TLR4 und MHC-SLA führt. Die Hemmung der HDAC-Aktivität und der DNA-Demethylierung zusammen durch die SFN Behandlung erhöht das Expressionsniveau von Immungenen nach 6 h der LPS-Stimulation. Außerdem, beeinträchtigt die SFN Behandlung die LPS-induzierten proinflammatorische Zytokine TNF-α und IL-1ß in den Zellkulturüberständen, aber es induziert eine Ansammlung von TNF-α im Zellysaten von MoDCs, was evtl. dazu beiträgt die Entzündung zu beschränken. Ebenfalls unterdrückt SFN die MoDCs Differenzierung von unreifen zu reifen DCs durch Herunterregulierung von CD40, CD80 und CD86 Molekülen was eine verbesserte Phagozytose zur Folge hat. So konnte in dieser Studie erstmals gezeigt werden, dass der HDAC-Inhibitor, SFN, eine dynamische Modulation auf DC Phänotypen ausübt einschließlich der differenzierten Reifung und Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen durch epigenetische Modifikationen, um die unspezifische Immunantwort in MoDCs positiv zu verändern.